張曉華 隋殿軍 劉淑榮 劉新宇 邸 琳 (吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 3002)

心力衰竭水潴留機(jī)制的主要途徑為心輸血量下降，血管加壓素水平升高，腎臟集合管V2受體激活，水通道蛋白(AQP)2激活和(或)基因表達(dá)上調(diào)，水重吸收增加。AQP 2主要受精氨酸加壓素(AVP)調(diào)控，而AVP通過腎臟V2受體調(diào)控AQP2，故AVP-V2受體-AQP2系統(tǒng)在調(diào)節(jié)機(jī)體水液代謝中起著重要作用〔1〕。益氣溫陽(yáng)活血利水法是目前公認(rèn)的治療心衰的方法，本實(shí)驗(yàn)擬了解益氣溫陽(yáng)活血利水法對(duì)于心衰水潴留的作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 Wistar大鼠，180～220 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;動(dòng)物等級(jí)Ⅱ級(jí);合格證編號(hào)為 SCXK-(吉)2008-0005。阿霉素按3 mg/kg的劑量溶于1 ml生理鹽水，腹腔注射，1次/w，共6 w，同時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行睡眠剝奪(連續(xù)5 d，0.5 h鬧鐘響1次)。正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水，6 w后通過觀察模型組大鼠的心衰癥狀(活動(dòng)量、食欲、發(fā)紺、水腫、尿量)及左室舒張末壓等指標(biāo)判斷心衰是否造模成功，以左室舒張末壓≥15 mmHg為心衰造模成功的主要指標(biāo)〔2〕。

1.2 藥物及儀器

1.2.1 藥物 益氣活血利水膠囊，內(nèi)容物為深棕色膏狀，5.503 6 g生藥/g膏。由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院資源所提供。益氣溫陽(yáng)活血利水膠囊人參、制附子、黃芪、桂枝、丹參、車前子、葶藶子、五加皮等藥物組成。陽(yáng)性藥:芪藶強(qiáng)心膠囊，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20120228。

1.2.2 主要儀器與試劑 SYBRGreen PCR試劑盒(ABI公司);Real-time PCR檢測(cè)儀(ABI-7300 ABI美國(guó));PCR擴(kuò)增儀。采用GAPDH為內(nèi)參照，登陸NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)查找大鼠V2R、AQP2及GAPDH的基因序列，用CmSuite8引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)V2受體、AQP2及GAPDH的上下游引物。AQP2上游引物5'TTGGTCTGGGCATCGGCATC 3'，下游引物5'GCTGTGGCGTTGTTGTGGAG 3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度238 bp;V2R上游引物 5'AGCAACAGCAGCCAGGAGGAAC 3'，下游引物 5'AACAGAGCCACAGCCAGGTCAG 3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 212 bp;GAPDH上游引物5'GTCGGTGTGAACGGATTTG 3'，下游引物5'TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度181 bp。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥 將造模成功的心衰大鼠，隨機(jī)分為模型組，芪藶強(qiáng)心組、中藥高、中、低劑量組(每組保證存活10只)，與對(duì)照組共6組。對(duì)照組、模型組分別灌胃10 ml/kg蒸餾水;陽(yáng)性中藥組灌胃0.65 g/kg芪藶強(qiáng)心膠囊;高、中、低劑量組分別灌胃益氣活血利水膠囊30、15、7.5生藥g/kg;連續(xù)灌胃給藥1個(gè)月。

1.3.2 標(biāo)本采集 組織標(biāo)本:灌胃4 w后，將大鼠斷頭處死，腹部正中切口，切開皮膚、肌肉、筋膜、腹膜，將腎組織周圍內(nèi)臟推向兩側(cè)，迅速取近髓腎組織，切半，一半浸泡在10%甲醛中固定48 h備用;一半置于－80℃冰箱中備用。

1.3.3 大鼠腎臟組織V2R及AQP 2 mRNA表達(dá)的影響 通過組織總 RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄 cDNA、將制備好的 cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后分別取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳終止后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描、拍照，采用儀器自帶軟件(ABI Prism 7500 SDS Software)分析產(chǎn)物CT值，計(jì)算ΔCT值，并以GAPDH內(nèi)參照CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正并通過軟件計(jì)算PCR產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組間用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組的V2R、AQP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P＜0.01，P＜0.05)，提示心衰時(shí) V2R、AQP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)增加;與模型組比較，各給藥組均使V2R表達(dá)不同程度的下調(diào)(P＜0.01)，使AQP2表達(dá)下調(diào)，其中中藥中、高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見表1。

表1 益氣溫陽(yáng)活血利水法對(duì)心衰大鼠V2R、AQP2 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=6)

表1 益氣溫陽(yáng)活血利水法對(duì)心衰大鼠V2R、AQP2 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P ＜0.01，2)P ＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05

組別 對(duì)照組 模型組 芪藶強(qiáng)心組 中藥低劑量組 中藥中劑量組 中藥高劑量組AVP V2R 0.011 8±0.006 72)0.036 8±0.014 91)0.009 7±0.003 23)0.010 6±0.003 53)0.011 0 ±0.002 73)0.011 1±0.008 23)AQP2 0.011 4±0.010 94)0.045 2± 0.019 22)0.027 6± 0.021 0 0.029 6±0.008 6 0.016 0±0.005 94)0.015 3±0.003 54)

3 討論

心衰是由不同病因引起的心脈“氣力衰竭”，心體受損，心動(dòng)無(wú)力，血流不暢，逐漸引起諸臟腑功能失調(diào)，進(jìn)而出現(xiàn)心悸、喘促、尿少、浮腫等為主要表現(xiàn)的危重病證〔3〕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心衰的病機(jī)主要沿著氣虛-氣陽(yáng)兩虛-氣(陽(yáng))虛血瘀-氣(陽(yáng))虛血瘀、痰濁水結(jié)的發(fā)展演變規(guī)律〔4，5〕，病性屬本虛標(biāo)實(shí)，“虛”、“瘀”、“痰”、“水”等在心衰發(fā)病中起到很主要的作用〔6〕，氣陽(yáng)虧虛，血瘀水結(jié)是慢性心力衰竭的病機(jī)關(guān)鍵，益氣溫陽(yáng)，活血利水是慢性心力衰竭的治療大法。近些年中醫(yī)學(xué)對(duì)于心衰的研究日趨增多，中醫(yī)藥治療心衰的優(yōu)勢(shì)也日趨顯現(xiàn)。

AQP2在腎臟集合管主細(xì)胞的管腔側(cè)膜和胞質(zhì)的囊泡內(nèi)表達(dá)，主要由AVP調(diào)控，在調(diào)節(jié)機(jī)體水液代謝中起著重要作用〔7〕，AVP-V2受體-AQP2是調(diào)節(jié)水代謝的一個(gè)系統(tǒng)，在整個(gè)系統(tǒng)中每個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常均可影響水液的代謝。心衰時(shí)AVP水平升高，V2受體及AQP2均異常表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)表明益氣溫陽(yáng)活血利水法可降低心衰時(shí)升高的AVP V2受體及AQP2 mRNA的表達(dá)，從而改善體內(nèi)水潴留。

1 許頂立，任 昊.充血性心力衰竭水潴留的機(jī)制-Aquaporin 2水通道蛋白的作用〔J〕.生理科學(xué)進(jìn)展，2000;31(2):150-2.

2 張興平，陳慶偉.慢性心力衰竭大鼠血清細(xì)胞因子的變化及其與左室舒張末壓的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2007;27(14):1348-9.

3 黃永生.中醫(yī)內(nèi)科教學(xué)與臨床〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:87.

4 唐蜀華.中醫(yī)藥治療充血性心力衰竭的臨床體會(huì)〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志，2003;37(1):23-5.

5 黃平東.中醫(yī)古籍對(duì)心力衰竭的論述探要〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003;21(4):592-3.

6 李立志.陳可冀治療充血性心力衰竭經(jīng)驗(yàn)〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2006;4(2):136-8.

7 Beitz E.The mammalian aquaporin water channel family:a promising new drug target〔J〕.Curr Med Chem，1999;6(6):457-67.