劉金之 薛 萍 張 濤 李曉林 楊倩倩 林 艷 王愛華

(山東大學附屬千佛山醫(yī)院保健神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟南 250014)

癲癇發(fā)作能引起明顯的神經(jīng)元損傷，其機制與癲癇后大量自由基形成及激活細胞死亡相關的蛋白酶有關〔1〕。凋亡誘導因子(AIF)是線粒體中的一個重要蛋白，可介導非天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶依賴性的細胞程序性死亡。最近有報道〔2〕，免疫抑制劑他羅利姆(FK506)在腦損傷和腦缺血模型中具有神經(jīng)保護作用，同時可抑制癲癇發(fā)作，提高大鼠生存率，但其作用機制尚待進一步研究。本研究采用氯化鋰-匹魯卡品制作癲癇大鼠模型，觀察癲癇發(fā)作后海馬組織中線粒體及AIF水平的變化，以及FK506對其的影響，進一步闡明FK506抗癲癇及腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠126只，體重250～280 g，由山東大學醫(yī)學院動物中心提供;氯化鋰、匹魯卡品均購自Sigma公司;一氧化氮(NO)定量、一氧化氮合酶(NOS)活性、丙二醛(MDA)定量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;羅丹明123購自碧云天公司生物技術研究所;AIF單克隆抗體購自Cell Signal Technology公司;COX-Ⅳ多克隆抗體購自Biovision公司;組蛋白Histone單克隆抗體購自Santa Cruz公司;神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)抗體、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體均購自Chemicon公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 ①隨機將健康雄性Wistar大鼠126只分為癲癇組(A組)、Fk506干預組(B組)、對照組(C組)各42只。A組與B組大鼠分別取6只于癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后6 h進行心臟灌注，免疫組化檢測;6只SE后24 h分離新鮮海馬組織，行線粒體相關測定;6只SE后7 d進行心臟灌注，免疫組化及尼氏染色。其余24只分為4組，分別于SE后2 h、6 h、24 h、7 d處死，分離新鮮海馬組織，－80℃保存。C組大鼠不建立癲癇模型，分別于對應時間點處死，標本處理同A、B組。②24只Wistar大鼠隨機分為癲癇組、FK506干預組、生理鹽水干預組、對照組，每組6只，F(xiàn)K506干預組在注射匹魯卡品之前24、1 h 2次腹腔注射FK506，生理鹽水干預組注射等體積生理鹽水;于癲癇發(fā)作24 h后處死，Western印跡檢測大鼠海馬線粒體和細胞核AIF的水平。

1.2.2 模型制作 A組和B組給予氯化鋰3 mol·L－1·kg－1腹腔注射，18～20 h后給予新配置的匹魯卡品30 mg/kg腹腔注射。B組于注射匹魯卡品之前24 h、1 h共2次給予FK506腹腔注射0.5 mg/kg。大鼠癲癇發(fā)作癥狀采用Racine(1972)分級標準。0級:無任何反應;Ⅰ級:面部陣攣:包括眨眼，動須，節(jié)奏性咀嚼等;Ⅱ級:Ⅰ級加節(jié)律性點頭;Ⅲ級:Ⅱ級加前肢肌陣攣，但無后肢直立位;Ⅳ級:Ⅲ級加后肢直立位;Ⅴ級:全面性強直-陣攣發(fā)作，并失去體位控制。出現(xiàn)急性SE 1 h后，給予水合氯醛200 mg/kg腹腔注射解除抽搐以降低死亡率，出現(xiàn)RacineⅣ級以上癥狀并存活者進入實驗組。

1.2.3 NO、MDA含量、NOS活性檢測 各組大鼠分別于2 h、6 h、24 h、7 d處死。將大鼠快速斷頭，取出腦組織，冷生理鹽水沖洗。根據(jù)大鼠立體定位圖譜，取雙側(cè)海馬，稱重后，以冷生理鹽水做勻漿介質(zhì)，研磨成10%組織勻漿，2 000 r/min，離心10 min，取上清液－80℃保存待測。NO、NOS、MDA檢測嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 線粒體膜檢測 MMP及線粒體大小的檢測采用新鮮海馬組織，用線粒體提取試劑盒提取線粒體，再用濃度為10 μmol/L的羅丹明123染液0.5 ml，室溫染色30 min。300目尼龍網(wǎng)過濾，上流式細胞儀，用Cell Quest軟件分析。

1.2.5 免疫組化檢測 各組大鼠于造模成功后6 h、7 d行灌注取材，大鼠水合氯醛350 mg/kg麻醉后，剪開胸腹腔，暴露心臟和肝臟，灌注針通過左心室心尖部穿刺至主動脈口，切開右心耳，快速灌注肝素化生理鹽水200 ml后，繼續(xù)4%多聚甲醛200 ml灌注，至大鼠四肢強直，肝臟變白后停止灌注，拔出穿刺針。開顱取全腦，放入4%多聚甲醛后固定12 h，移入20%、30%蔗糖分別過夜。冰凍冠切已沉糖的腦組織，層厚10 μm。用ABC法進行免疫組化染色。用PBS取代一抗做陰性對照。

1.2.6 海馬AIF水平檢測 Western印跡法檢測海馬AIF的變化:各實驗組大鼠快速斷頭取腦，分離海馬，加入細胞裂解液，冰上孵育，離心后棄上清液;沉淀中加入細胞核裂解液或線粒體分離介質(zhì)，冰上孵育后離心，上清液為核蛋白提取液，沉淀物為線粒體蛋白，加入蛋白上樣液，沸水煮后備用。40 g蛋白質(zhì)樣品在恒壓下行聚丙烯酰胺凝膠電泳;置于轉(zhuǎn)模槽中恒流電轉(zhuǎn)2 h;將硝酸纖維素膜放入溶于脫脂牛奶中，室溫振蕩1～2 h;洗滌后，將硝酸纖維素膜放入稀釋后的一抗溶液中4℃過夜;洗滌后，將硝酸纖維素膜放入合理稀釋后的二抗溶液中室溫振蕩1 h;洗滌后，將化學發(fā)光液試劑均勻涂于硝酸纖維素膜，曝光、顯影、定影，應用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)拍照;計算目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值，表示相對含量。

1.2.7 形態(tài)學觀察 各組大鼠于造模成功后7 d行灌注取材，尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.3 圖像與統(tǒng)計學處理 圖像采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)對切片進行圖像分析。所有切片分析在同一強度，同一放大倍數(shù)下進行。每只大鼠隨機取相同部位的4張切片，分別對陽性細胞進行測定。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用χ2檢驗及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學觀察 A、B兩組大鼠在注射匹魯卡品后均出現(xiàn)SE，但是潛伏期和發(fā)作強度有所不同。B組大鼠的潛伏期延長(P＜0.01)，且發(fā)作強度級別降低(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠癲癇發(fā)作至Ⅳ級潛伏期及發(fā)作程度分級(±s)

表1 大鼠癲癇發(fā)作至Ⅳ級潛伏期及發(fā)作程度分級(±s)

與A組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 n 癲癇發(fā)作至Ⅳ級潛伏期(s)Ⅴ級發(fā)作百分比A組Ⅳ級發(fā)作百分比42 46.4±9.1 47.62% 52.38%B組 42 69.3±9.72) 78.57%1) 21.43%1)

2.2 海馬NO含量與NOS活性測定結(jié)果 A組大鼠在SE后海馬組織中NO的含量升高，6 h出現(xiàn)第1個高峰，在7 d時再次升高。結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)的活性同樣在SE后升高，6 h達高峰，但隨后下降。而誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的活性則是緩慢升高，在7 d時達到高峰。比較A、B、C各組6 h時NO、cNOS活性和7 d時NO、iNOS活性的不同，同一時間點的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表1，表2。

2.3 海馬MDA含量測定結(jié)果 SE后A組大鼠海馬組織中MDA的含量升高，一直持續(xù)到SE后7 d。與A組相比，7 d時B組大鼠MDA的含量明顯降低(P＜0.01)。見表1，表2。

2.4 線粒體相關檢測

2.4.1 MMP檢測 MMP為早期反映細胞凋亡的一個指標，MMP降低，凋亡相關因子釋放，引起凋亡的發(fā)生。用相對熒光強度來反映MMP的狀態(tài)，與A組相比(128.87±6.43)，B組大鼠神經(jīng)元細胞MMP明顯升高(163.35±4.86，P＜0.05)。C組最高(75.64±8.7)。

2.4.2 線粒體大小 凋亡發(fā)生時，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(MPTP)開放使介質(zhì)進入線粒體，導致線粒體膨脹，線粒體腫大。流式細胞儀可以通過檢測線粒體前向光散射(FSC)增大，來反映MPTP的開放。與C組(98±4.57)和B組(139±3.82)比較，A組神經(jīng)元細胞線粒體腫大(116±4.34，P＜0.05)。

2.5 免疫組化檢測結(jié)果 nNOS、iNOS表達陽性細胞胞質(zhì)及突起呈棕色或棕褐色著色。正常大鼠海馬區(qū)可見少量的nNOS、iNOS表達，SE后6 h時A組大鼠海馬nNOS陽性細胞數(shù)較C組明顯增多(P＜0.05)，B組nNOS陽性細胞數(shù)較A組明顯降低(P＜0.05);SE后7 d時A組大鼠海馬iNOS陽性細胞數(shù)較C組明顯增多(P＜0.05)，而B組較A組明顯降低(P＜0.05)。見圖1，表1，表2。

2.6 海馬AIF水平檢測 Western印跡結(jié)果提示:與癲癇組比較，F(xiàn)K506干預組大鼠海馬組織線粒體AIF水平顯著增高，而細胞核AIF水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均 P＜0.05)。見圖2，表3。

表1 不同時間點NO、cNOS、iNOS、MDA含量的變化(±s，n=6)

表1 不同時間點NO、cNOS、iNOS、MDA含量的變化(±s，n=6)

與C組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 NO(μmol/gprot) cNOS活性(U/mgprot) iNOS活性(U/mgprot) MDA含量(nmol/gprot)C組 0.24±0.022 1.12±0.079 0.26±0.081 2.36±0.211 A組2 h 0.45±0.0261) 1.92±0.0631) 0.29±0.063 3.18±0.098 A組6 h 0.52±0.0162) 2.85±0.0662) 0.30±0.061 3.29±0.1331)A組24 h 0.31±0.0251) 1.89±0.1021) 0.66±0.0891) 5.57±0.2581)A組7 d 0.52±0.0212) 1.51±0.1391) 1.40±0.1402) 9.33±0.6002)

表2 各組不同時間點NO、iNOS活性、MDA含量變化(±s，n=6)

表2 各組不同時間點NO、iNOS活性、MDA含量變化(±s，n=6)

與C組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與A組比較:3)P＜0.05

組別 6 h NO(μmol/gprot) 7 d NO(μmol/gprot) 7 d iNOS(U/mgprot) 6 h cNOS(U/mgprot) MDA 含量(nmol/gprot)2.25±0.211 A組 0.52±0.0261) 0.53±0.0241) 1.40±0.1401) 2.85±0.0661) 9.33±0.6001)B組 0.41±0.0162)3) 0.35±0.022 1.13±0.1042)3) 2.25±0.0772)3) 5.65±0.2912)3)C組 0.23±0.022 0.23±0.011 0.26±0.080 1.12±0.079

表3 SE后24 h各組大鼠細胞核及線粒體AIF的表達(±s，n=6)

表3 SE后24 h各組大鼠細胞核及線粒體AIF的表達(±s，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05;與FK506干預組比較:2)P＜0.05

組別 細胞核 線粒體對照組3.87±0.68 1.24±0.24 1.21±0.66 1.52±0.21癲癇組 5.93±0.831)2) 0.77±0.231)2)生理鹽水干預組 6.12±0.791)2) 0.73±0.191)2)FK506干預組

2.7 海馬形態(tài)學觀察 對照組海馬形態(tài)學結(jié)構(gòu)正常，有大量致密錐體細胞，排列規(guī)則，胞核完整，胞質(zhì)里可見深染的尼氏小體;癲癇組海馬可見神經(jīng)元缺失、變性、壞死，尼氏小體數(shù)量較少，甚至出現(xiàn)尼氏小體的溶解、消失，存活神經(jīng)元數(shù)目顯著少于對照組和FK506干預組;FK506干預組海馬存活神經(jīng)元數(shù)量較癲癇組明顯增加。見圖3。

圖1 免疫組化示癲癇持續(xù)狀態(tài)后nNOS和iNOS的表達

圖2 SE后24 h各組大鼠細胞核及線粒體AIF的表達

圖3 SE后7 d海馬CA3區(qū)神經(jīng)元變化(尼氏染色，×400)

3 討論

癲癇發(fā)作可導致NO大量釋放，引起氧化應激反應，在癲癇發(fā)作和癲癇誘導的細胞損傷中發(fā)揮重要作用〔3～5〕。NOS包括nNOS，內(nèi)皮型(eNOS)和iNOS，前兩種合稱為結(jié)構(gòu)型 NOS，即cNOS，由于無法直接檢測nNOS的活性，國外實驗〔6〕通過免疫印跡法證實癲癇時nNOS是cNOS活性增加的主要因素，因此本研究通過檢測cNOS的活性來間接反映nNOS的活性。MDA為脂質(zhì)過氧化物降解的產(chǎn)物，具有很強的生物毒性，對腦組織有直接損害作用〔7〕。本研究結(jié)果提示NO早期的升高可能是由于cNOS的活性及表達升高，而nNOS是cNOS活性增加的主要因素，因此早期的升高可能是由于nNOS的活性及表達升高，而晚期則是由iNOS產(chǎn)生大量NO。同時SE后6 h海馬組織MDA顯著升高，含量隨著時間及癲癇的加重而升高，與以往報道一致〔8〕，說明NO的增多可通過脂質(zhì)過氧化的增強發(fā)揮其致癇性和細胞毒性作用。在FK506處理的大鼠，SE后MDA的增加受到抑制，進一步證明FK506可抑制NO誘發(fā)的氧化應激反應，抑制脂質(zhì)過氧化反應，使MDA生成減少。免疫組化證實FK506可使SE后nNOS、iNOS的表達降低，提示FK506可抑制nNOS及iNOS的表達，進而抑制氧化應激反應。

線粒體對維持細胞能量代謝和正常功能起重要作用。大多數(shù)細胞發(fā)生凋亡時均伴隨線粒體功能與結(jié)構(gòu)改變〔9〕，而MMP的改變在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用〔10〕。由于線粒體膜上各種生物泵的作用，使膜內(nèi)外維持著不同梯度的離子濃度，進而產(chǎn)生MMP。細胞發(fā)生凋亡時首先表現(xiàn)為MMP迅速下降，一旦線粒體跨膜電位(Δψm)耗散，細胞將進入不可逆的死亡過程，而導致線粒體跨膜電位耗散的主要原因是線粒體MPTP通道開放。目前認為線粒體MPTP通道開放是誘發(fā)細胞凋亡與壞死的共同通路〔11〕。氧化應激可導致線粒體去極化及MPTP通道開放，引起線粒體內(nèi)細胞色素C、AIF、Smac等釋放，從而啟動凋亡蛋白酶依賴及非凋亡蛋白依賴的細胞凋亡途徑。因此，PTP開放是凋亡開始的一個關鍵環(huán)節(jié)。由于線粒體存在內(nèi)負外正電位，特異性正電性熒光染料羅丹明123可進入線粒體，且只與線粒體內(nèi)膜特異性結(jié)合。PTP開放時，膜電位消失，熒光強度下降。羅丹明123熒光強度降低，反映線粒體數(shù)量減少和功能降低。同時，線粒體膨脹后，其顆粒性狀改變。因此，流式細胞儀可通過同時檢測線粒體前向光散射(FSC)增大和線粒體90°側(cè)向光散射(SSC)改變反映線粒體PTP的開放。

AIF是第一個被鑒定出可以不依賴于半胱氨酸天冬酶信號通路而直接介導細胞發(fā)生凋亡的分子。AIF為一種位于線粒體膜間隙的黃素蛋白，既具有細胞凋亡活性又具有氧化還原酶活性，但二者的作用是解偶聯(lián)的。細胞受到凋亡刺激后，AIF從線粒體易位到胞質(zhì)中，再易位到核，在核中與染色體結(jié)合，使染色體凝集，并斷裂成約50 kb的大片段，從而引起細胞凋亡〔12〕。免疫組化、Western印跡及病理結(jié)果進一步證實癲癇組大鼠在SE后AIF從線粒體易位到細胞核，神經(jīng)元變性壞死，數(shù)目減少，排列散亂，F(xiàn)K506可減輕神經(jīng)元損傷。

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