王愛梅 許 濤 劉雙月 牟 華 (遼寧醫(yī)學院生理學教研室，遼寧 錦州 121001)

卡那霉素(KM)作為一種氨基糖苷類抗生素(AmAn)，具有嚴重的耳毒性副作用，可導致耳蝸毛細胞損傷。目前認為，KM的耳毒性機制與其促進氧自由基的過量生成并進而引發(fā)脂質過氧化反應有關。據此，國內外學者應用抗氧化劑來防護KM 的耳毒性〔1，2〕。α-硫辛酸(LA)是一種新型抗氧化劑，具有清除氧自由基、螯合鐵離子等多種作用〔3〕，可有效防護慶大霉素對大鼠耳蝸毛細胞的損傷〔4〕。本文研究LA對KM所致離體培養(yǎng)小鼠耳蝸毛細胞損傷的防護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 生后3 d的昆明小鼠120只(240耳)，雌雄兼用，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。硫酸KM粉劑購自美國Ameresco公司，LA、牛血清白蛋白(BSA)和TRITC-鬼筆環(huán)肽均購自美國Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，Ⅰ型鼠尾膠購自中國杭州生友公司，基礎Eagle培養(yǎng)基(BME)干粉、碳酸氫鈉和Hanks液購自北京邁晨生物科技有限公司，SOD試劑盒、MDA試劑盒和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 耳蝸基底膜取材 用75%乙醇噴灑小鼠全身進行皮膚表面消毒，斷頭后沿矢狀縫剪開顱骨，去除腦組織以充分暴露顱底。體視顯微鏡下取出整個耳蝸并移入預冷的Hanks液中。打開耳蝸殼，依次剝離螺旋韌帶、前庭膜及血管紋等結構，用游絲鑷夾住基底膜底回末端，將基底膜沿蝸軸完整分離。

1.2.2 耳蝸螺旋器培養(yǎng) 預先在培養(yǎng)皿中滴入10 μl新鮮配制的膠原凝膠液(由Ⅰ型鼠尾膠、10×BME和2% 碳酸氫鈉按9∶1∶1比例配制而成)，室溫下放置15～20 min，待膠原凝膠液凝固后加入含1%BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基1 ml。將分離后的每個基底膜平鋪到凝膠表面。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，再加入1 ml培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基完全覆蓋凝膠，然后將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 實驗分組及離體KM耳毒模型的制備 經培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基。將基底膜隨機分為6組，每組40條。其中A組為對照組，加入2 ml新鮮培養(yǎng)基;B組為KM組，加入2 ml含有0.3 mmol/L KM的新鮮培養(yǎng)基;C、D、E組為KM+LA組，分別加入2 ml含有0.3 mmol/L KM和不同濃度LA(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L和1.0 mmol/L)的新鮮培養(yǎng)基;F組為LA組，加入2 ml含有1.0 mmol/L LA的新鮮培養(yǎng)基。各組均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后終止實驗。每組隨機選取10條基底膜用于TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色，另外30條用于SOD活力和MDA含量測定。

1.2.4 TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色 終止實驗時吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS溶液，4℃下固定過夜。PBS漂洗3次后取下帶有基底膜的凝膠，浸入0.25%Triton X-100溶液中，室溫下處理20 min。然后移入到TRITC-鬼筆環(huán)肽(1∶200稀釋)溶液中，室溫下避光染色30 min。PBS漂洗后將帶有基底膜的凝膠移至滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察耳蝸毛細胞形態(tài)變化。

1.2.5 耳蝸毛細胞計數 將標本置于熒光顯微鏡下，選取0.17 mm標尺為一個視野，從基底膜頂端向底端連續(xù)觀察毛細胞，并將毛細胞計數結果輸入計算機，應用耳蝸毛細胞定量分析軟件(KHRI Cytocochleograms，Version 3.0)，分別選取距離耳蝸蝸頂12% ～20%、44% ～52%、84% ～92%的三個區(qū)域，自動計算出毛細胞的缺失百分率。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量測定 終止實驗時吸出培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每6條基底膜合成一份標本放入離心管中，每組5份標本。將標本于常溫下超聲粉碎30 s，1 000 r/min下離心8 min。分別取上清液0.05 ml，應用比色法和硫代巴比妥酸法分別測定耳蝸組織中SOD活力和MDA含量，同時用考馬斯亮藍法進行組織蛋白定量。SOD活力單位用nU/mgpro表示，MDA含量用nmol/mgpro表示。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗。

2 結果

2.1 TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色 熒光顯微鏡下，可見TRITC標記的鬼筆環(huán)肽染色呈現紅色熒光，主要定位在毛細胞的纖毛束。A組耳蝸毛細胞形態(tài)結構完好，外毛細胞(OHC)的纖毛呈典型的“V”字形排列，內毛細胞(IHC)的纖毛排列成“一”字形;B組耳蝸毛細胞出現纖毛倒伏、排列紊亂等形態(tài)改變，同時伴有毛細胞的大量缺失，尤其底回IHC、OHC均全部崩解，呈瘢痕狀結構;C、D和E組耳蝸毛細胞的形態(tài)改變較KM組有所減輕，毛細胞的缺失亦比KM組顯著減少，并且隨著LA濃度的增大，其效應亦明顯增強;F組耳蝸毛細胞纖毛排列整齊，無倒伏及融合，且毛細胞無缺失。見圖1。

2.2 耳蝸毛細胞計數 與A組比較，B組耳蝸IHC、OHC缺失率均明顯增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。C、D和E組耳蝸IHC、OHC缺失率較B組明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，并且隨著LA濃度的逐漸增大，耳蝸底回IHC、OHC缺失率亦逐漸減小，呈明顯的量效關系，且各劑量間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01);F組與A組比較無顯著差異。見表1和表2。

表1 各組耳蝸IHC缺失率(%，±s，n=10)

表1 各組耳蝸IHC缺失率(%，±s，n=10)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.01;與C組比較:3)P＜0.05;與D組比較:4)P＜0.01，下表同

組別12% ～20% 44% ～52% 84% ～92%A 0.31±0.41 0.32±0.48 0.67±0.48 B 16.10±9.561) 57.62±4.161) 94.50±1.811)C 0.53±1.062) 8.31±4.201) 30.91±7.872)D 1.42±1.652) 6.61±4.241) 10.09±3.782)3)E 0.93±0.932) 4.06±2.612)3) 5.16±3.592)3)4)F 1.24±0.92 1.39±0.68 1.11±0.73

表2 各組耳蝸OHC缺失率(%，±s，n=10)

表2 各組耳蝸OHC缺失率(%，±s，n=10)

組別12% ～20% 44% ～52% 84% ～92%A 0.36±0.52 0.32±0.48 0.67±0.48 B 23.30±6.761) 65.13±8.541) 94.90±0.891)C 1.08±1.532) 9.18±1.272) 42.85±4.302)D 1.43±1.412) 8.39±0.862) 27.94±6.032)3)E 1.08±0.772) 3.73±1.422)3) 6.97±2.192)3)4)F 1.04±0.80 1.08±0.97 0.84±0.46

2.3 LA對小鼠耳蝸組織中SOD活力和MDA含量的影響 B組耳蝸組織中SOD活力明顯下降，MDA含量則明顯增多，與A組比較有顯著性差異(P＜0.05)。C、D和E組耳蝸組織中SOD活力較B組明顯增強，而MDA含量則較B組明顯減少(P＜0.05)，并且呈明顯的量效關系。F組耳蝸組織中SOD活力明顯高于A組(P＜0.05)，MDA含量則較A組無明顯差異。見表3。

表3 不同濃度LA對小鼠耳蝸SOD活力和MDA含量的影響(±s，n=5)

表3 不同濃度LA對小鼠耳蝸SOD活力和MDA含量的影響(±s，n=5)

組別 SOD(nU/mgpro) MDA(nmol/mgpro)A 46.21±1.25 3.23±0.15 B 22.54±1.141) 9.43±0.311)C 28.86±1.602) 6.07±0.062)D 35.04±0.632) 5.37±0.152)E 39.42±1.912)4) 4.60±0.102)4)F 56.02±1.511)3.08±0.08

3 討論

研究表明，AmAn可與鐵離子形成復合物，該復合物具有氧化還原活性，能活化氧分子，生成過量的超氧陰離子自由基(O－2)〔1〕。O－2不僅可直接破壞細胞內蛋白質、核酸等生物大分子，而且還能派生出羥自由基、過氧化氫等其他毒性分子，從而加重對機體的損害。此外，O2－及其派生物還可引發(fā)細胞生物膜上的脂質過氧化并因此生成過多的脂質過氧化物。SOD能清除O－2，保護細胞免受損傷，其活力高低可間接反映機體清除自由基的能力。MDA是脂質過氧化物在機體內的代謝終產物，其含量多少可反映機體內脂質過氧化程度，間接反映細胞損傷程度。本研究表明KM對離體培養(yǎng)的小鼠耳蝸毛細胞造成損傷。氧自由基及其引發(fā)的脂質過氧化反應參與了KM對離體小鼠耳蝸毛細胞的損傷。

LA是一種二巰基化合物，可直接與鐵離子螯合成親脂性復合物，從而抑制鐵離子催化的花生四烯酸氧化，以減少O－2的產生，阻止細胞發(fā)生脂質過氧化〔5〕，是目前已知天然抗氧化劑中效果最強的一種。在體實驗表明，LA能有效減輕慶大霉素對大鼠耳蝸毛細胞的損害〔4〕。此外，LA亦對噪聲暴露下大鼠的耳蝸損傷和毛細胞缺失具有防護作用〔6〕。最近研究顯示，LA可通過抑制耳蝸內尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3(NOX3)的表達，以減少活性氧的生成，從而有效防護順鉑所致大鼠聽力喪失〔7〕。本研究說明LA在離體情況下能有效防護KM對小鼠耳蝸毛細胞的損傷，能有效提高SOD活力，以清除過量的O－2，進而減少脂質過氧化物及代謝終產物MDA的生成，保護小鼠耳蝸毛細胞免受KM的毒性破壞。

1 Wang AM，Sha SH，Lesniak W，et al.Tanshinone(Salviae miltiorrhizae extract)preparations attenuate aminoglycoside-induced free radical formation in vitro and ototoxicity in vivo〔J〕.Antimicrob Agents Chemother，2003;47(6):1836-41.

2 Jiang H，Sha SH，Schacht J.NF-κB pathway protects cochlear hair cells from aminoglycoside-induced ototoxicity〔J〕.J Neurosci Res，2005;79(5):644-51.

3 Ghibu S，Richard C，Vergely C，et al.Antioxidant properties of an endogenous thiol:alpha-lipoic acid，useful in the prevention of cardiovascular diseases〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2009;54(5):391-8.

4 袁 波，姜學鈞，趙慕蘭，等.α-硫辛酸對慶大霉素所致大鼠耳毒性損害的保護作用〔J〕.中國中西醫(yī)結合耳鼻咽喉科雜志，2009;17(4):185-8.

5 Suh JH，Moreau R，Heath SH，et al.Dietary supplementation with(R)-alpha-lipoic acid reverses the age-related accumulation of iron and depletion of antioxidants in the rat cerebral cortex〔J〕.Redox Rep，2005;10(1):52-60.

6 Pouyatos B，Gearhart C，Nelson-Miller A，et al.Lipoic acid and 6-formylpterin reduce potentiation of noise-induced hearing loss by carbon monoxide:preliminary investigation〔J〕.J Rehabil Res Dev，2008;45(7):1053-64.

7 Mukherjea D，Jajoo S，Kaur T，et al.Transtympanic administration of short interfering(si)RNA for the NOX3 isoform of NADPH oxidase protects against cisplatin-induced hearing loss in the rat〔J〕.Antioxid Redox Signal，2010;13(5):589-98.