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        高血糖對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及細胞色素C表達的影響

        2013-09-12 06:08:06林冬融韓江全胡泳濤遵義醫(yī)學院第五附屬珠海醫(yī)院神經內科廣東珠海519100
        中國老年學雜志 2013年16期
        關鍵詞:高血糖腦缺血線粒體

        林冬融 韓江全 胡泳濤 (遵義醫(yī)學院第五附屬(珠海)醫(yī)院神經內科,廣東 珠海 519100)

        研究表明,高血糖是非糖尿病急性卒中患者高發(fā)病率和高死亡率的重要獨立危險因素,同時也可能是導致局部或廣泛缺血后預后更差的危險因素〔1~3〕。細胞色素C(Cyt-C)作為一個普遍的線粒體起源的細胞死亡信號〔4〕,在細胞凋亡過程中起著重要的作用。但高血糖是否影響線粒體的凋亡相關途徑,目前尚未明了。本實驗檢測高血糖條件下大鼠腦缺血再灌注損傷的神經功能評分及Cyt-C的表達,探討高血糖加重腦缺血再灌注損傷的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠70只(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)中心實驗室提供),8~9周齡,體重250~300 g,隨機分為三大組:高血糖組30只、正常血糖組30只、假手術組10只。前兩組再隨機按腦缺血2 h再灌注后6、12、24 h分為三個亞組,每組10只。

        1.2 方法

        1.2.1 高血糖大鼠模型的制備 大鼠實驗前禁食12 h,自由進水。高血糖組于造模前30 min尾靜脈注射25%葡萄糖4 g/kg,造成高血糖狀態(tài)。正常血糖組則以同樣方法注射等量18%D-甘露醇。用血糖儀在栓線前測定血糖值。

        1.2.2 腦缺血再灌注模型的制備 實驗大鼠以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,采用改良Longa線栓法建立大腦中動脈阻塞再灌注模型。所有實驗大鼠均栓塞右側大腦中動脈(MCA)。栓塞2 h拔出栓線,分別于再灌注后6、12、24 h(每個亞組10只)處死。假手術組僅做頸部正中切口,暴露右側頸總動脈,縫合皮膚。模型成功的標志是動物蘇醒后出現(xiàn)同側的Horner征(眼裂變小,眼球內陷)和對側以前肢為重的偏癱。

        1.2.3 神經功能評分 參照Zea-Longa5級4分制評分標準,分別于各時間點對實驗大鼠進行神經功能評分:0分:無神經功能缺失癥狀;1分:輕度局灶性神經功能缺失(大鼠被提尾懸空時病灶對側前肢呈屈曲、抬高、肩內收、肘關節(jié)伸直);2分:中度局灶性神經功能缺失(有向癱瘓側旋轉征象);3分:重度局灶性神經功能缺失(有向病灶對側跌倒征象);4分:無自發(fā)活動及意識水平下降。

        1.2.4 細胞凋亡檢測 采用TUNEL法,嚴格按照試劑盒(武漢博士德公司)說明書進行。顯微鏡下在缺血半暗帶區(qū)取5個高倍視野,計算陽性細胞數(shù)(鏡下細胞核內有棕黃色顆粒)。

        1.2.5 免疫組化檢測Cyt-C表達 采用SABC法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后進行擴原修復。阻斷內源性過氧化物酶的活性,滴加正常非免疫動物血清封閉??贵w稀釋液1∶100稀釋Ⅰ抗(Cytochrome C Rabbit mAb,購自武漢博士德生物工程有限公司)。滴加Ⅰ抗,4℃孵育過夜,次日室溫復溫30 min,移去Ⅰ抗,以0.01 mol/L PBS沖洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG,室溫孵育10 min,PBS洗。滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液,室溫孵育10 min,PBS洗。DAB顯色,蘇木素復染,返藍。脫水透明封片,顯微鏡觀察,陽性細胞胞質呈棕黃色。在每張切片皮質區(qū)隨機取不相重復的5個視野,數(shù)碼相機拍照,MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)對所拍圖象進行分析,統(tǒng)一光飽和度、亮度和色調,取平均灰度級算術均數(shù)用于各組間比較。

        1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件分析系統(tǒng)處理,以±s表示,采用單因素方差分析檢驗。

        2 結果

        2.1 造模前血糖值 高血糖組血糖(16.48±1.88)mmol/L水平明顯高于正常血糖組(5.91±0.34)mmol/L(P<0.01)。

        2.2 神經功能評分 假手術組全部動物均為0分,未見神經功能缺損;其余兩組在大鼠麻醉清醒后即出現(xiàn)不同程度的神經功能缺損。正常血糖缺血再灌注組與假手術組比較,神經功能缺損程度明顯加重(P<0.01);高血糖組與正常血糖組比較,神經功能缺損加重(P<0.05)。見表1。

        2.3 TUNEL染色及光鏡下凋亡細胞計數(shù) 光鏡下假手術組可見少量凋亡細胞(0.50±0.53,細胞核內可見棕黃色顆粒)。正常血糖組再灌注6 h可見凋亡細胞,12 h逐漸增高,于再灌注24 h達高峰。高血糖組于再灌注6、12、24 h凋亡細胞計數(shù)多于相同時間段內正常血糖組(P<0.05)。見表2,圖1。

        2.4 Cyt-C免疫組織化學染色 假手術組未見Cyt-C表達(151.33±3.22);正常血糖組再灌注6 h可見Cyt-C表達,12 h逐漸增高,于再灌注24 h達高峰;高血糖組于再灌注6、12、24 h Cyt-C表達明顯高于正常血糖組相應各亞組。見表3,圖2。

        表1 神經功能評分比較(±s,n=10)

        表1 神經功能評分比較(±s,n=10)

        與假手術組比較:1)P<0.01;與相同時間點正常血糖組比較:2)P<0.01,3)P <0.05,下表同

        組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 1.40±0.521) 2.20±0.631)2)再灌注12 h 2.60±0.521) 3.50±0.711)2)再灌注24 h 3.30±0.481) 3.80±0.421)2)

        表2 凋亡細胞計數(shù)比較(±s,n=10)

        表2 凋亡細胞計數(shù)比較(±s,n=10)

        組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 11.40±1.511) 12.80±1.141)3)再灌注12 h 15.40±1351) 18.80±1.481)2)再灌注24 h 17.50±1.081) 19.10±0.991)2)

        表3 Cyt-C免疫組化灰度級比較(±s,n=10)

        表3 Cyt-C免疫組化灰度級比較(±s,n=10)

        組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 117.40±1.501) 114.30±1.341)2)再灌注12 h 115.30±1.641) 109.00±1.561)2)再灌注24 h 113.10±1.521) 106.70±1.771)2)

        圖2 各組腦缺血半暗帶皮質區(qū)Cyt-C免疫組織化學染色(IHC,×400)

        3 討論

        腦缺血的發(fā)病機制,涉及能量代謝障礙、局部酸中毒、炎癥介質釋放、自由基損傷、細胞內Ca2+超載、興奮性氨基酸的毒性作用等。近年來研究〔5,6〕表明,神經細胞凋亡在腦缺血神經細胞損害中發(fā)揮重要作用。急性缺血性腦損傷發(fā)生后,梗死的周邊部位即半暗帶區(qū)的神經元損傷主要通過凋亡途徑進行,凋亡神經元的多少決定著缺血引起的損害最終范圍大小,細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要環(huán)節(jié),而線粒體則是細胞凋亡過程中重要的細胞器〔7〕。線粒體是通過向胞漿釋放Cyt-C等途徑參與各種凋亡過程,尤其是Cyt-C從線粒體向細胞漿的重新分布,這與各因素誘導凋亡產生有密切的關系。

        高血糖既是缺血性腦血管病的危險因素之一,也是缺血區(qū)神經元損傷加重的因素。高血糖加重腦缺血損傷的機制是多途徑、多水平的,包括有高血糖缺血腦組織中乳酸聚集,加重細胞內酸中毒,對缺血部位神經元產生直接毒性;高血糖促進興奮性氨基酸堆積;高血糖增強一氧化氮(NO)毒性作用;高血糖破壞血腦屏障,并促進梗死出血等,血管損傷和乳酸堆積酸中毒是最基本的途徑。本實驗結果顯示,Cyt-C的表達強度與凋亡細胞的數(shù)目存在一定關系。Cyt-C是一種可溶蛋白,正常時位于線粒體膜內并松散地附著于線粒體膜的內表面,當Cyt-C從細胞線粒體轉移到胞質,則可通過免疫組織化學方法檢測到。釋放到細胞質中的Cyt-C通過結合凋亡蛋白酶激活因子-1和caspase-9后,再激活caspase-3,這是導致細胞凋亡產生的中心事件〔8〕。以上結果表明通過線粒體通路加重細胞凋亡過程,是高血糖加重腦缺血損傷的機制之一。

        1 Kostulas N,Markaki I,Cansu H,et al.Hyperglycaemia in acute ischaemic stroke is associated with an increased 5-year mortality〔J〕.Age Ageing,2009;38(5):590-4.

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        3 Bruno A.Management of hyperglycemia during acute stroke〔J〕.Curr Cardiol Rep,2009;11(1):36-41.

        4 Kelvin Cain,Bratton SB,Cohen GM.The Apaf-1 apoptosome:a large caspase-activating complex〔J〕.Biochimie,2002;9(2-3):203.

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