余先祥 蔣 斌 賈佑華 (合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)檢教研室，巢湖238000)

前期實驗在應(yīng)用組織芯片技術(shù)和免疫組化方法分析葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein 78 kD，GRP78)與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，GRP78的表達水平與胃癌細胞分化程度相關(guān)［1］。為了進一步明確GRP78的表達水平與胃癌細胞分化程度的關(guān)系，探討GRP78協(xié)助判定胃癌細胞分化程度的可行性，本研究通過Western blot和免疫組化兩種方法，檢測胃癌組織中GRP78蛋白的表達，分析GRP78蛋白在不同分化胃癌組織中的水平差異，用以判斷應(yīng)用GRP78協(xié)助判定胃癌細胞分化程度的可行性。

1 材料與方法

1．1 組織標本 收集我市某三甲醫(yī)院病理組織學(xué)明確診斷胃癌患者術(shù)后組織，取部分新鮮標本－70℃凍存，其余作石蠟包埋標本。根據(jù)病理科診斷結(jié)果，按照WHO病理組織學(xué)分類［2］，依時間順序分別挑取較為典型的高、中、低分化腺癌各20例為研究對象，其中新鮮凍存標本作Western blot分析，存檔石蠟標本作免疫組化檢測，所有患者術(shù)前均未接受過放、化療。

1．2 主要試劑 兔抗人GRP78單克隆抗體購自Santa Cruz公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗體購自武漢博士德公司，即用型非生物素免疫組化EliVisionTMplus檢測試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒等均購自福州邁新公司。

1．3 實驗方法

1．3．1 Western blot取新鮮組織 20 ～40 mg剪碎，經(jīng)PBS洗滌后加入1 ml預(yù)冷的PMSF裂解液置冰上，用勻漿器充分勻漿，冰浴10分鐘后轉(zhuǎn)至EP管中12 000 r/min、4℃離心 15分鐘，收集總蛋白－20℃凍存。Lowry法蛋白定量，每泳道20 μg上樣量經(jīng)十二烷基磺酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，TBST封閉液室溫下封閉2小時，加一抗兔抗人GRP78(工作濃度1∶1 000)4℃孵育過夜，依次經(jīng)二抗、ECL化學(xué)發(fā)光后用Typhoon分子成像系統(tǒng)(Amersham Biosciences公司)分析灰度，計算GRP78/β-actin灰度比值。

1．3．2 免疫組化染色 組織標本片常規(guī)脫蠟水化，高壓鍋抗原熱修復(fù)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性、10%非免疫性山羊血清封閉非特異性位點，滴加一抗兔抗人GRP78(工作濃度1∶500)4℃冰箱中過夜，其他按照即用型非生物素免疫組化EliVisionTMplus檢測試劑盒使用說明書步驟操作。

1．3．3 免疫組化染色結(jié)果判斷 GRP78的陽性表達指數(shù)用染色強度分數(shù)×染色細胞比例分數(shù)表示。染色強度按顏色評分:完全陰性0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分;染色細胞比例按陽性細胞百分比評分:＜5%、5% ～24%、25% ～49%、50% ～74%、≥75% 分別評為 0、1、2、3、4 分［3］。

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，組間兩兩比較采用Dunnett's T法。

2 結(jié)果

2．1 Western blot分析 Western blot檢測結(jié)果顯示三種分化程度胃腺癌組織中均有不等量GRP78蛋白的表達(圖1)。分析 GRP78/β-actin灰度比值，高、中、低分化胃癌組織分別為 0．47 ±0．18、0．74 ±0．19、1．00 ± 0．25，組間比較差異有顯著性意義(P ＜0．05)。

2．2 免疫組化檢測 GRP78蛋白表達定位于細胞漿，呈淡黃色、黃色或棕黃色(見圖2)，三種分化程度胃癌組織GRP78蛋白的陽性表達指數(shù)分別為:高分化癌4．45 ±1．82;中分化癌 6．65 ±2．16;低分化癌8．55±2．48。組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05)。

圖1 Western blot法檢測不同分化胃腺癌組織GRP78的表達Fig．1 Expression of GRP78 in different differentiated gastric adenocarcinoma were detected by Western blot

圖2 免疫組化法檢測不同分化胃腺癌組織GRP78的表達(SP，×200)Fig．2 Expression of GRP78 in different differentiated gastric adenocarcinoma were detected by immunohistochemistry(SP，×200)

3 討論

GRP78又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，作為一種分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運，在多種腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志性蛋白［4］。多個研究顯示GRP78的表達水平與腫瘤細胞分化程度呈負相關(guān)［5，6］，據(jù)此有人認為研究GRP78的表達水平可能會成為一種新的有價值的判斷腫瘤細胞分化程度和臨床分期的分子標記物。在本研究中，Western blot和免疫組化兩種檢測方法均證實了GRP78的表達水平與胃癌細胞分化程度的相關(guān)性，統(tǒng)計結(jié)果顯示低分化胃癌高于中、高分化胃癌，三組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步分析中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)低分化胃癌表達水平明顯強于中、高分化胃癌，但有幾例低分化胃癌表達水平較低，而中、高分化組中也有部分病例呈強陽性表達。因此我們認為，盡管GRP78在不同分化胃癌組織中存在水平差異，但單純依靠GRP78表達的水平來判斷胃癌細胞分化程度尚缺乏臨床可操作性。

1 余先祥，謝本俊，張林杰．胃癌組織中GRP78的表達與臨床病理特征的相關(guān)性分析［J］．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012;47(6):681-683．

2 竇紅漫，程 平，吳賽青 et al．多藥耐藥蛋白 P-gp，Topo-II與p53蛋白在胃癌組織中的表達及意義［J］．安徽醫(yī)藥，2010;14(11):1294-1296．

3 Xing X，Lai M，Wang Y et al．Overexpression of glucose-regulated protein 78 in colon cancer［J］．Clin Chim Acta，2006;364(1-2):308-315．

4 王 麗，侯麗麗，吳亞歐 et al．E2F-1在胃腺癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中對Mcl-1的調(diào)控作用［J］．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011;46(4):332-336．

5 劉 芳，邢曉明，李玉軍 et al．結(jié)直腸腺癌組織Grp78表達及意義［J］．青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009;45(3):252-254．

6 Daneshmand S，Quek M L，Lin E et al．Glucose-regulated protein GRP78 is up-regulated in prostate cancer and correlates with recurrence and survival［J］．Hum Pathol，2007;38(10):1547-1552．