高志玲 孫麗媛 戴 琎 (吉林省白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，白城137000)

結(jié)核桿菌熱休克蛋白70(HSP70)能刺激固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)，交叉提呈抗原給MHCⅠ類分子產(chǎn)生特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，被廣泛地應(yīng)用于抗腫瘤、抗病毒疫苗的佐劑［1，2］。近年來，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Ⅱ型糖尿病等自身免疫性疾病模型中發(fā)現(xiàn)，HSP70可以產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子IL-10，并促進(jìn)Treg的產(chǎn)生，從而保護(hù)自身免疫性疾病的發(fā)展［3，4］。上述結(jié)果表明HSP70具有刺激和抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)的雙重活性，但具體機(jī)制尚不明確。免疫抗原過大過小都可以引起抗原的免疫耐受［5］，由此推斷HSP70這種雙重的免疫學(xué)功能可能與劑量相關(guān)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將不同劑量的HSP70在體外刺激小鼠樹突狀細(xì)胞(DC)，檢測了DC表面分子CD86的表達(dá)情況以及IL-10的表達(dá)水平，此外我們將不同劑量的HSP70免疫NOD小鼠，觀察HSP70對NOD小鼠糖尿病發(fā)生率以及Treg的產(chǎn)生的影響。旨在揭示HSP70雙重免疫學(xué)功能的機(jī)制并為其應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1．1 材料 結(jié)核桿菌熱休克蛋白70購自樂博生物有限公司;IL-10試劑盒購于上海百沃科技有限公司;IL-4、GM-CSF購于 PeproTech公司，IMDM培養(yǎng)基干粉、新生牛血清、胰蛋白酶均購于Gibco，F(xiàn)icoll液購于湖南晶科生物科技有限公司;其它常用試劑購買于國產(chǎn)試劑公司。實(shí)驗(yàn)所需的C57BL/6小鼠購于長春生物制品所;6周齡的雌性非肥胖糖尿病小鼠(non-obese diabetes mice，NOD mice)購于北京維通利華;抗CD4-PEcy5抗體、抗Foxp3-PE抗體購買于eBioscience。

1．2 方法

1．2．1 樹突狀細(xì)胞的制備 取3只C57BL/6小鼠眼球取血，用Ficoll液從外周血分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，分鋪在12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入1 ml細(xì)胞懸液，培養(yǎng)2小時后，用PBS洗板3次，去除未貼壁的淋巴細(xì)胞，每孔加入500 U/ml IL-4、500 U/ml GM-CSF和10%的IMDM培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第三天補(bǔ)加細(xì)胞因子，第五天時，收集未貼壁和貼壁不牢的細(xì)胞即為未成熟的樹突狀細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 HSP70刺激DC表達(dá)CD86分子 將培養(yǎng)到第5天的未成熟的樹突狀細(xì)胞與不同濃度的HSP70(0、2、10、50、100、200 μg/ml)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日，收集培養(yǎng)上清用于細(xì)胞因子檢測，收集的細(xì)胞用FITC標(biāo)記的抗CD86單克隆抗體染色40分鐘，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1．2．3 HSP70對IL-10表達(dá)量的影響 將收集的DC培養(yǎng)上清，按照IL-10 ELISA試劑盒說明書操作，檢測上清中IL-10的含量。

1．2．4 HSP70對NOD小鼠糖尿病模型發(fā)病率的影響 將30只6周齡的NOD小鼠隨機(jī)分成3組，對照組皮下免疫PBS，其余兩組小鼠分別免疫不同劑量的 HSP70(10 μg/只、100 μg/只)，一周一次，免疫3次，每周用葡萄糖試紙檢測小鼠尿液中葡萄糖的含量，當(dāng)小鼠尿中的葡萄糖水平達(dá)到1 000 mg/dl以上時，認(rèn)定是糖尿病模型成立。

1．2．5 HSP70對 NOD小鼠脾細(xì)胞中 Treg比例的影響 各組分別處死3只NOD小鼠，取脾臟制備脾細(xì)胞，制成脾細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，加入 1．5 μl抗 CD4-PEcy5 抗體，避光孵育15分鐘后，加入固定/破膜工作液對細(xì)胞固定和破膜，再加入抗 Foxp3-PE 抗體各1．5 μl，染色30分鐘后清洗，流式細(xì)胞儀分析Treg細(xì)胞百分率。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16．0軟件分析，用Kaplan-Meier分析NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率，用單因素方差方法(one-way ANOVA)分析余下所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P＜0．05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01是有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 不同劑量HSP70對DC成熟的影響 流式分析結(jié)果顯示在 0～50 μg/ml濃度范圍內(nèi)，隨著HSP70濃度增高，表達(dá)CD86的DC陽性百分率逐漸升高，在50 μg/ml時CD86表達(dá)量最高，與其在2 μg/ml時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．037)，當(dāng)濃度達(dá)到100、200 μg/ml時，DC表達(dá) CD86的陽性率反而降低，均低于50 μg/ml時的陽性率(P ＜0．05)，因此說明在小劑量范圍內(nèi)HSP70可以刺激DC的成熟，大劑量的HSP70反而可以抑制DC的成熟，見圖1。

2．2 HSP70刺激DC產(chǎn)生IL-10具有劑量依賴性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSP70在體外可刺激DC產(chǎn)生IL-10，隨著劑量的增加，IL-10的產(chǎn)生也逐漸增多(P＜0．05)，見圖2。

圖1 不同劑量HSP70對DC表達(dá)CD86的影響Fig．1 Effect of HSP70 at different dosage on the expression of CD86 on DC

圖2 不同劑量的HSP70對IL-10表達(dá)量的影響Fig．2 Effect of HSP70 at different dosage on the expression of IL-10

2．3 大劑量 HSP70降低 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大劑量的HSP70可以顯著降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率，與對照組比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，而小劑量 HSP70不能降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率，見圖3。

圖3 HSP70對NOD小鼠糖尿病發(fā)病率影響Fig．3 Effect of HSP70 on diabetes incidence of NOD mice

圖4 HSP70對NOD小鼠Treg影響Fig．4 Effect of HSP70 on Treg of NOD mice

2．4 大劑量HSP70增加NOD小鼠的Treg 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大劑量的HSP70可以顯著增加NOD小鼠糖尿病的Treg，與對照組比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)，見圖4。

3 討論

結(jié)核桿菌熱休克蛋白70(HSP70)能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于疫苗的佐劑［1，2］。然而在自身免疫性疾病模型中，HSP70也可能引起免疫耐受，但是具體的機(jī)制不明［3，4］。本實(shí)驗(yàn)研究表明HSP70在小劑量時可以刺激DC的成熟，大劑量時可以抑制DC的成熟。進(jìn)一步研究表明HSP70可以在體外刺激DC產(chǎn)生大量的抑制性細(xì)胞因子IL-10，并呈劑量依賴性，這或許能夠解釋大劑量的HSP70能夠引起免疫抑制的原因。

有研究表明HSP60也能在自身免疫性疾病模型中發(fā)揮免疫抑制活性，并伴有Treg和IL-10水平升高［6］。小劑量的HSP70之所以能夠刺激免疫系統(tǒng)可能是由于HSP70刺激產(chǎn)生其他的刺激性因子，其刺激活性作用強(qiáng)于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-10的抑制活性，所以在小劑量時主要表現(xiàn)為激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。隨著劑量的增大，IL-10等抑制因子逐漸增多，其抑制活性可能大于其激活的刺激性因子的活性，表現(xiàn)為HSP70的免疫抑制活性。熱休克蛋白96(gp96)在用于腫瘤疫苗佐劑時小劑量的抗腫瘤效果要優(yōu)于其大劑量的抗腫瘤效果，其機(jī)制是gp96同時刺激特異性的CTL和Treg的產(chǎn)生，小劑量gp96激發(fā)的CTL的活性要強(qiáng)于Treg的抑制活性，而大劑量的gp96激發(fā)Treg的比例顯著升高，其發(fā)揮的抑制活性要強(qiáng)于其激發(fā)的CTL，所以限制了其作為腫瘤疫苗佐劑的活性［7］。NOD小鼠可以自發(fā)進(jìn)展為自身免疫性糖尿病，而研究表明Treg細(xì)胞能夠抑制自身免疫性的發(fā)展，Treg比例升高可以顯著抑制NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率［8］。體外實(shí)驗(yàn)表明，大劑量的HSP70可以產(chǎn)生大量抑制性因子IL-10。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，大劑量的HSP70可以顯著誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，抑制NOD小鼠的糖尿病發(fā)病率。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明HSP70的免疫激活和抑制活性與其劑量相關(guān)，用作疫苗佐劑時應(yīng)用小劑量，用于治療自身免疫性疾病時應(yīng)加大使用的劑量，為HSP70的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

1 Massa C，Melani C，Colombo M P．Chaperon and adjuvant activity of hsp70:different natural killer requirement for cross-priming of chaperoned and bystander antigens［J］．Cancer Res，2005;65(17):7942-7949．

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8 D'Alise A M，Auyeung V，F(xiàn)euerer M et al．The defect in T-cell regulation in NOD mice is an effect on the T-cell effectors［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008;105(50):19857-19862．