龍世棋 商正玲 左 麗 (貴陽醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽550004)

登革病毒(Dengue virus，DEN)是單股正鏈RNA病毒，由于缺乏有效的治療手段，DEN感染已成為威脅人類健康的全球性公共安全問題。DEN致病與病毒毒力和機(jī)體免疫功能有關(guān)［1］，但確切的機(jī)制尚不明確。巨噬細(xì)胞是重要的固有免疫細(xì)胞，也是DEN感染的重要靶細(xì)胞［2，3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞并不是功能單一的細(xì)胞，根據(jù)活化狀態(tài)和功能的不同可將其分為M1型即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞和M2型即替代性活化的巨噬細(xì)胞［4，5］。巨噬細(xì)胞表達(dá)多種模式識別受體，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是天然免疫中重要的模式識別受體，在機(jī)體抗病原體感染中發(fā)揮重要的作用。其中，TLR7可識別病毒ssRNA，經(jīng)病毒ssRNA刺激的TLR7啟動MyD88依賴的信號通路，誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子釋放，因而在介導(dǎo)抗病毒免疫中發(fā)揮重要的作用［6，7］。本研究擬用小鼠Ana-1巨噬細(xì)胞系作為實(shí)驗對象，探討DEN2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化及其TLR7表達(dá)的情況，為DEN致病機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞株 登革2型病毒NGC株，為本室保藏，常規(guī)方法增殖病毒，根據(jù)Reed-Muench法測定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose，TCID50)為 10-6.33/100 μl。小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞系(Ana-1)，由本室保藏。

1.1.2 主要試劑 改良型RPMI1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;rmIFN-γ、rmIL-4購自 Cytolab公司;LPS購自Sigma公司;Trizol購自大連寶生物工程有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR試劑盒購自Invitrogen公司;兔抗鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、精氨酸酶 1(Arginase 1，Arg-1)多克隆抗體購自Santa Cruz公司;兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體購自Abcam公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自Abmart公司;Mouse TNF-α ELISA試劑盒購自eBioscience公司;硝酸纖維膜素購自Millipore公司;BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Pierce公司。

1.1.3 引物設(shè)計 引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗分組 取對數(shù)生長期的Ana-1細(xì)胞以5×105/孔接入6孔培養(yǎng)板;病毒感染組:DEN2感染復(fù)數(shù)(MOI)為1;M1型極化對照組:以rmIFN-γ(終濃度100 U/ml)+LPS(終濃度10 ng/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞M1型極化;M2型極化對照組:以rmIL-4(終濃度10 U/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞M2型極化［8］;正常對照組:加入細(xì)胞維持液 2 ml。分別收集各組 24、72、120小時Ana-1細(xì)胞及培養(yǎng)上清做后續(xù)檢測。

1.2.2 直接免疫熒光法檢測病毒抗原 常規(guī)方法處理細(xì)胞，兔血清室溫封閉60分鐘，用FITC標(biāo)記的兔抗DEN2抗體室溫孵育1小時，PBS洗滌后于熒光顯微鏡下用波長488 nm的激發(fā)光觀察FITC標(biāo)記的熒光并攝取圖像。

1.2.3 細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 收集細(xì)胞，加入1 ml Trizol試劑，混勻，按試劑操作說明書提取細(xì)胞總RNA。取2 μg總RNA為模板，以寡核苷酸Oligo(dT)為引物，體系25 μl，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RNA及 cDNA分別于 -80℃和-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細(xì)胞總蛋白提取 常規(guī)方法提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR引物核酸序列Tab．1 The primer sequence for PCR

1.2.5 熒光定量PCR檢測 利用基因引物加熒光染色復(fù)合物SYBR Green mix進(jìn)行RT-PCR檢測。總反應(yīng)體系為 25 μl:其中 SYBR Green mix 12.5 μl，上下游引物各 0.5 μl，模板 cDNA 50 ng，ddH2O 補(bǔ)足至25 μl。循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性2分鐘;一個循環(huán)94℃ 30秒，64℃ 30秒;35個循環(huán)擴(kuò)增。記錄Ct值并計算 2-△△Ct。

1.2.6 Western蛋白印跡分析 將變性的總蛋白50 μg經(jīng) 12%SDS-PAGE 電泳，再以 0.8 mA/cm2恒流轉(zhuǎn)印至NC膜。用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1小時，再分別用相應(yīng)的兔抗鼠iNOS(1∶1 000)、Arg-1(1∶1 000)、TLR7(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)抗體4℃孵育過夜。次日PBST洗滌，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃孵育2小時，ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，讀取光密度值。

1.2.7 TNF-α的檢測 采用雙抗體夾心ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中TNF-α含量，嚴(yán)格按照小鼠TNF-α ELISA試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 以上各組實(shí)驗至少獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析計量資料以±s表示，以P值＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直接免疫熒光法鑒定DEN2 直接免疫熒光法檢測Ana-1細(xì)胞上DEN2 E蛋白。結(jié)果顯示，在病毒感染組Ana-1細(xì)胞中可見FITC標(biāo)記的DEN2 E蛋白抗體所發(fā)出的黃綠色熒光，正常組Ana-1細(xì)胞未見黃綠色熒光(圖1)。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增曲線 對DEN2 E基因、iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12p40、GAPDH 基因分別進(jìn)行 RTPCR檢測，結(jié)果顯示本實(shí)驗各目的基因特異性強(qiáng)(圖2)、擴(kuò)增效率高(圖3)。

2.3 DEN2在Ana-1細(xì)胞的復(fù)制 實(shí)時定量RTPCR顯示被DEN2感染后Ana-1細(xì)胞病毒核酸在72小時達(dá)峰值，120小時明顯下降。2-ΔΔCt值分別為159.98±37.80、3.69±0.38，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值 ＜0.01)(圖4)。

圖1 直接免疫熒光法鑒定DEN2吸附Ana-1Fig．1 Identification of DEN2 in Ana-1 by direct immunofluorescence assay

圖2 各目的基因RT-PCR熔解曲線圖Fig．2 RT-PCR dissolution curve of the purpose genes

圖3 各目的基因RT-PCR擴(kuò)增曲線圖Fig．3 RT-PCR amplification curve of the purpose genes

圖4 實(shí)時定量RT-PCR檢測Ana-1細(xì)胞中DEN2的表達(dá)Fig．4 mRNA expression of DEN2 in Ana-1 cell by Real time RT-PCR

表2 各實(shí)驗組Ana-1培養(yǎng)上清中 TNF-α濃度 (pg/ml，±s，n=3)Tab．2 The dynamic level of TNF-α in the Ana-1 culture supernatants(pg/ml，±s，n=3)

表2 各實(shí)驗組Ana-1培養(yǎng)上清中 TNF-α濃度 (pg/ml，±s，n=3)Tab．2 The dynamic level of TNF-α in the Ana-1 culture supernatants(pg/ml，±s，n=3)

Note:Compared with control group，M2 group，1)P ＜0.01.

Time Groups24 h 72 h 120 h Control 33.24±6.62 36.12±5.12 35.12±7.74 M1 256.09±10.111)372.02±12.141)340.29±12.441)M2 46.81±8.21 52.81±8.41 49.06±7.13 DEN2 166.62±11.141)454.72±13.411)221.75±11.181)

圖5 實(shí)時定量PCR檢測Ana-1細(xì)胞中iNOS、Arg-1的表達(dá)Fig．5 mRNA expression of iNOS，Arg-1 in Ana-1 cell by Real time RT-PCR

圖6 Ana-1細(xì)胞iNOS、Arg-1蛋白表達(dá)Fig．6 Expression of iNOS，Arg-1 protein in Ana-1 cell

圖7 實(shí)時定量PCR檢測Ana-1細(xì)胞中IL-12p40、IL-10的表達(dá)Fig．7 mRNA expression of IL-12p40，IL-10 in Ana-1 cell by Real time RT-PCR

圖8 Ana-1細(xì)胞TLR7蛋白表達(dá)Fig．8 Expression of TLR7 protein in Ana-1 cell

2.4 iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白表達(dá) 對各組細(xì)胞的iNOS、Arg-1 mRNA進(jìn)行實(shí)時定量RT-PCR檢測，結(jié)果顯示DEN2感染組、M1型極化對照組iNOS mRNA水平較正常組及M2型極化對照組顯著升高(P ＜0.01)，72 小時達(dá)峰值，2-ΔΔCt值分別為29.09 ±3.70、18.35±3.52;DEN2感染組 24、72小時的Arg-1 mRNA水平明顯低于同期M2型極化對照組(P＜0.01)(圖5)。Western blot顯示 DEN2感染組、M1型極化對照組iNOS蛋白在24、72、120小時均高于同期正常對照組及M2型極化對照組，72小時達(dá)峰值。Arg-1蛋白表達(dá)顯著低于M2型極化組(圖6)。

2.5 細(xì)胞因子產(chǎn)生情況 DEN2感染組IL-12p40 mRNA 水平在 72 小時達(dá)峰值，2-ΔΔCt值為 11.1 ±2.41，明顯高于 M2型對照及正常對照組(P＜0.05);IL-10 mRNA水平與同期正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05，圖7)。DEN2感染組、M1型極化對照組培養(yǎng)上清中TNF-α濃度均明顯高于同時段M2型極化對照及正常對照組(P＜0.01)，且在72小時達(dá)到峰值，隨后下降(表2)。

2.6 TLR7表達(dá)情況 Ana-1細(xì)胞被DEN2感染后TLR7蛋白表達(dá)下降，低于同期正常對照組，且呈逐漸下降趨勢。M1、M2型極化對照組TLR7較正常對照組無明顯差異(圖8)。

3 討論

巨噬細(xì)胞具有明顯的異質(zhì)性，在不同的環(huán)境因素影響下可以極化為不同的亞群，表現(xiàn)出截然不同的生物學(xué)功能［9，10］。巨噬細(xì)胞是登革感染的靶細(xì)胞［11］，本研究用直接免疫熒光及實(shí)時定量PCR驗證了DEN2能感染小鼠巨噬細(xì)胞系A(chǔ)na-1，并發(fā)現(xiàn)病毒載量隨感染時間延長呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，為后續(xù)試驗提供了合適的感染體系。

巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS和Arg-1的表達(dá)及活性受到精密調(diào)控，高表達(dá)iNOS，低表達(dá)Arg-1被認(rèn)為是M1型極化的指標(biāo)［12］。本研究證實(shí)DEN2感染 Ana-1細(xì)胞后iNOS mRNA及蛋白均有不同程度升高，與病毒載量呈正相關(guān)。Arg-1 mRNA及蛋白無明顯升高，說明DEN2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞可向M1型極化。產(chǎn)生不同細(xì)胞因子是極化巨噬細(xì)胞的重要特征，M1分泌大量IL-12，少量IL-10［13］。我們對細(xì)胞因子產(chǎn)生情況進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)DEN2感染組72小時IL-12p40 mRNA水平明顯上升，而IL-10 mRNA相對表達(dá)量無明顯升高。從細(xì)胞因子水平說明DEN2誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞向M1型極化。病毒感染早期抗原提呈細(xì)胞可產(chǎn)生IL-12，能促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞的活性，在抗病毒感染中有重要作用。IL-12的增高往往提示機(jī)體免疫應(yīng)答加強(qiáng)，對病變進(jìn)展有重要影響，并可能是導(dǎo)致DEN感染者不同臨床轉(zhuǎn)歸的一個重要因素［14］。然而，本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)Ana-1細(xì)胞誘導(dǎo)的M1型極化對照組IL-12p40 mRNA水平并未如預(yù)期般上升，這可能與不同細(xì)胞模型誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因素不同有關(guān)。有文獻(xiàn)認(rèn)為IL-10的分泌可以作為巨噬細(xì)胞M2型活化的表型標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)IL-4誘導(dǎo)的M2型極化對照組IL-10 mRNA相對表達(dá)量并無明顯增加，推斷IL-10對于Th2類細(xì)胞因子誘導(dǎo)的M2模型不具有重要意義，這與李康等研究結(jié)果相似［8］。

巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α是重要的促炎性細(xì)胞因子［15］。也是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要啟動因子。TNF-α水平過高，可啟動細(xì)胞因子反應(yīng)的病理生理過程。TNF-α可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞及白細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞的趨化，引起局部炎癥反應(yīng)及自身組織器官的損害。本實(shí)驗中，病毒感染組TNF-α濃度顯著升高且TNF-α的濃度與病毒核酸呈正相關(guān)，推斷登革病毒感染所引發(fā)疾病的嚴(yán)重程度與TNF-α的表達(dá)有密切的關(guān)系，與 Jens、Betty 等研究結(jié)果相似［16，17］。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫中重要的模式識別受體。其中與病毒識別有關(guān)的主要是 TLR3、TLR7、TLR8、TLR9。TLR7 參與了巨噬細(xì)胞對 ssRNA 的識別［18］。Peifang 等［19］認(rèn)為TLR7對DEN ssRNA的識別及其介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的釋放，是漿細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，Ana-1細(xì)胞被DEN2感染后明顯下調(diào)了TLR7的表達(dá)。推測可能是DEN2部分抑制了Ana-1細(xì)胞的功能，使TLR7表達(dá)下調(diào)，且這種下調(diào)并不隨時間延長、病毒載量的減少而恢復(fù)，可能是DEN2免疫逃逸的機(jī)制之一。

本研究從精氨酸代謝關(guān)鍵酶水平及IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子水平證實(shí)了DEN2感染Ana-1細(xì)胞后誘導(dǎo)其向M1型極化。極化早期由于巨噬細(xì)胞分泌的iNOS及促炎性細(xì)胞因子較少，且病毒下調(diào)了巨噬細(xì)胞TLR7的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞對病毒的殺傷能力弱，病毒可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。隨著病毒載量的增加，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化程度加深，iNOS及促炎性因子增多，產(chǎn)生較強(qiáng)的抗感染作用，病毒載量下降。

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