叢銳軍 符培亮 劉偉 李曉華 吳海山 吳宇黎 趙輝 王波

（第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院骨科，上海200003）

人工關節(jié)置換術后感染是災難性并發(fā)癥，可導致手術失敗，患者可能需要移除假體甚至截肢，帶來巨大的精神和經(jīng)濟負擔。1個月內(nèi)的急性感染采用保留假體、清創(chuàng)、使用抗生素治療的手術成功率為26%～70%[1,2]，而慢性感染需二期翻修[3-6]，二期翻修是感染治療的金標準[7-10]，原則是徹底清除所有異物，全身使用抗生素，局部使用抗生素骨水泥間置器，感染臨床治愈后植入翻修假體，術中行冰凍切片。對于兩次手術時間、兩種手術方式及抗生素骨水泥間置器的類型均存在爭議[11-14]。此外，臨床上很多患者和文獻中報道，即使感染臨床治愈后，部分患者會出現(xiàn)傷口周圍特發(fā)性紅腫和不明原因的濕疹，無論是否使用抗生素，這些癥狀都能得到緩解[15]。本文探索人工關節(jié)感染翻修術后近期關節(jié)和髓腔內(nèi)細菌的殘留情況，為上述爭議和癥狀提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康成年新西蘭大白兔64只（其中4只為備用組），雌雄不限，體重2.5～3.5 kg，平均2.8 kg（第二軍醫(yī)大學藥學院動物實驗中心提供），清潔級，適應性喂養(yǎng)1周，自由進食、飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制作與實驗設計：使用膝前外側入路，暴露兔膝關節(jié)前髁，注意保護髕腱及前髁韌帶，于負重面適當位置開槽，避免損傷交叉韌帶和后外側神經(jīng)血管，用定制銼刀修整截骨面，植入定制型生物假體（圖1），檢查假體牢固度，確定假體位置及牢固度較好后沖洗關閉傷口。術后第2 d注入SE SAL65164金葡菌（第二軍醫(yī)大學微生物教研室提供）1×106CFU，1周后進行關節(jié)腔穿刺細菌培養(yǎng)，1只動物死亡，1只穿刺培養(yǎng)未得到細菌，備用組2只替代，30只感染模型構建成功[16]。實驗組30只翻修術后第1～4周分別行關節(jié)灌洗液沉渣細菌培養(yǎng)和關節(jié)灌洗液沉渣遺傳物質(zhì)聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）檢測，細菌培養(yǎng)結果為培養(yǎng)組，PCR檢測結果為PCR組，將各時間點的培養(yǎng)組陽性率和PCR組檢出率進行組間比較，同時將不同時間點的培養(yǎng)組陽性率和PCR組檢出率進行時序性比較。此外，設立30只為陰性對照組，旨在說明未行關節(jié)翻修的關節(jié)腔內(nèi)細菌可以持續(xù)檢出，陰性對照組不用于統(tǒng)計分析。

1.2.2 翻修手術：采用二期翻修手術，關節(jié)置換原切口入路，切開外側肌群后暴露兔膝關節(jié)，避免損傷髕韌帶、前髁韌帶、側副韌帶和交叉韌帶；徹底清除關節(jié)腔內(nèi)異常組織，取出原假體，雙氧水、洗必泰、生理鹽水反復沖洗浸泡后，更換手套及手術器械，實驗組使用中空多孔關節(jié)假體＋植入式輸液港系統(tǒng)（巴德公司提供）作為間置器填充，關節(jié)假體為定制的生物型假體，出現(xiàn)嚴重骨缺損的個體采用大直徑假體，不使用骨水泥填充（圖2）；陰性對照組未行手術干預。實驗組動物二期翻修中1例出現(xiàn)假體周圍骨折，備用組代替[11,14]。

1.2.3 圍手術期處理：每天觀察實驗組動物體溫、進食和傷口情況，觀察遠端肢體運動情況。實驗組術后1周內(nèi)通過輸液港行關節(jié)內(nèi)腔頭孢唑啉1 g溶于500 ml生理鹽水灌洗25 min，后用生理鹽水2500 ml沖洗，全身使用頭孢唑啉0.1 gTid（肌內(nèi)注射），1周后停用抗生素。陰性對照組僅全身使用抗生素0.1gTid（肌肉注射）。

1.2.4 觀察指標：術后第1～4周通過輸液港行關節(jié)腔內(nèi)2500 ml生理鹽水灌洗，全部灌洗液離心（6000×g，10 min），取沉渣，兩等分，分別用于細菌培養(yǎng)[17]和PCR檢測23S rRNA基因、nuc基因[18,19]。細菌培養(yǎng)條件為5%去纖維羊血培養(yǎng)基，37℃恒溫增菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，陰性結果繼續(xù)培養(yǎng)1周，陽性結果行過氧化氫實驗和凝固酶實驗，并抽提DNA鑒定菌株類型。

1.2.5 DNA抽提和PCR方法：使用QIAamp DNA套裝（Qiagen，德國）提取DNA。PCR反應體系每30 μl包含1 μl nuc引物或23S rRNA引物10 pmol（Invitrogen，美國），5 μl DNA 模版，14 μl PCR 液（DNA聚合酶MgCl2,dNTPs）（Roche，德國），9 μl蒸餾水，自動擴增儀Mastercycler（Eppendorf，德國）完成擴增（表1）。二期翻修術后第4周，隨機處死實驗組15只，分別取假體周圍、髓腔中段、髓腔遠端組織，冰凍切片后革蘭氏染色找金葡菌（圖3），并取部分組織塊增菌培養(yǎng)，并行過氧化氫實驗和凝固酶實驗[17,20]。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)對實驗者和統(tǒng)計員雙盲。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，使用配對樣本Pearson卡方分析比較各時間點培養(yǎng)組陽性率和PCR組檢出率的組間差異，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異；使用Pearson卡方分析兩兩比

較不同時間點的培養(yǎng)組陽性率和PCR組檢出率的時序性差異，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 實驗組及對照組大體觀察

實驗組術后體溫均正常、傷口愈合好，術后第3周縫線開始陸續(xù)脫落，遠端肢體運動好，進食量未見明顯減少；對照組術后7只體溫升高，進食量減少，傷口紅腫、滲出、愈合差，術后3～4周，其中4只竇道形成，每天換藥可見淡黃色膿性滲出物5～20 ml，細菌學檢驗為凝固酶陽性、過氧化氫酶陽性、革蘭氏陽性球菌，DNA鑒定為SE SAL65164金葡菌株，其中1只同時檢出革蘭氏陰性桿菌。

2.2 實驗組細菌培養(yǎng)結果和PPCCRR檢測結果

術后第1周灌洗液呈棕紅色、懸濁液，離心后得到灰紅色沉淀3.6 g，第2周灌洗液呈淡紅色、懸濁液，離心后得到灰白色沉淀3.2 g，第3周灌洗液為無色透明懸液，離心后得到灰白色沉淀3.5 g，第4周灌洗液為無色透明懸液，沉淀后得到黃白色沉淀3.0 g。細菌培養(yǎng)結果示：術后第1～4周培養(yǎng)組陽性率分別為10%、3.33%、3.33%、3.33%7只標本有細菌生長，余未見細菌生長，細菌學檢驗示凝固酶陽性葡萄球菌，DNA鑒定為SE SAL65164金葡菌株；第2～4周，其中1只可見細菌生長，余未見細菌生長。術后第4周處死的實驗組15只冰凍切片革蘭氏染色，該只股骨后側肌肉組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性球菌存在，同部位組織塊血培養(yǎng)基培養(yǎng)，見凝固酶陽性、過氧化氫酶陽性球菌生長，DNA鑒定為SE SAL65164金葡菌株。PCR檢測特定23S rRNA基因和nuc基因的組內(nèi)分布結果示：術后第1～4周兩種基因的組內(nèi)分布無統(tǒng)計學差異，其檢出率分別為83.33%、40.00%、30.00%、26.67%（表2、3）。

2.3 各時間點的組間差異和各組的時序性差異

實驗組二期翻修術后各時間點的培養(yǎng)組結果和PCR組結果均有統(tǒng)計學差異（表4），認為術后第1～4周灌洗液沉淀物的細菌培養(yǎng)陽性率和PCR檢出率不一致，且細菌培養(yǎng)結果均低于PCR檢測結果。各組的時序性比較發(fā)現(xiàn)，實驗組二期翻修術后第1～4周的PCR組結果持續(xù)下降，第1周的PCR檢出率與第2～4周比較有統(tǒng)計學差異（P=0.001,0.000,0.000），而第2～4周之間無顯著性差異（圖4）。術后細菌培養(yǎng)結果時序分析顯示，術后第1～4周的細菌培養(yǎng)陽性率比較無統(tǒng)計學差異（P=0.605）。第1周的細菌培養(yǎng)陽性率和PCR檢出率與陰性對照組均無統(tǒng)計學差異，認為實驗組干預有效，細菌培養(yǎng)陽性率與PCR檢率率的差別并非由假陽性誤差偏倚引起。

表2 實驗組翻修術后第1～4周23S rRNA和nuc基因的PCR檢測結果

表3 對照組翻修術后第4周23S rRNA和nuc基因的PCR檢測結果

表4 實驗組翻修術后各時間點的細菌培養(yǎng)組陽性率和PPCCRR組檢出率比較（%%）

3 討論

目前關節(jié)周圍感染的治療方式包括清創(chuàng)保留假體抗生素治療、一期清創(chuàng)+翻修術、二期翻修術。早期的大樣本關節(jié)置換感染認為：抗生素骨水泥假體二期翻修，平均隨訪4.8年，手術成功率超過80%，近期研究認為生物型假體一期翻修，隨訪3～4年，可以得到相似的結果，Soriano等[2]認為急性感染2周內(nèi)，細菌菌膜未形成前行關節(jié)清創(chuàng)術，保留假體治療后，感染再發(fā)率達30%；本實驗在輸液港幫助下，全身、局部使用抗生素，合并局部灌洗治療1周后，灌洗液細菌培養(yǎng)陽性率為10%，金葡菌遺傳物質(zhì)檢出率為83.33%，作者認為急性感染單純清創(chuàng)治療的有效率值得商榷。二期翻修放置spacer填充雖增加了手術次數(shù)，但細菌清除率得到保證，實驗中的中空假體+輸液港裝置可實現(xiàn)術后實時灌洗和關節(jié)液培養(yǎng)，同時減少置管的逆向感染等問題，減少患者創(chuàng)傷。

傳統(tǒng)觀點無論一期手術還是二期翻修的前提是徹底清除細菌，關節(jié)周圍感染主要是革蘭陽性球菌，其中以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為主。文獻報道，即使在嚴格傷口護理及每天換藥的情況下，不同時間培養(yǎng)得到的細菌亦可能不一致，本實驗對照組中1只出現(xiàn)類似情況。該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因未見文獻報道。文獻證實，隨著生存環(huán)境的變化細菌會改變以適應環(huán)境；關節(jié)腔內(nèi)結構復雜，滑膜組織和肌肉間隙非常多，當處于休眠狀態(tài)的細菌被包裹在這些軟組織間隙時，是否會引起機體的炎癥反映，是否具有趨化作用和免疫源性，目前尚未得到研究。清創(chuàng)后4周內(nèi)，雖然細菌培養(yǎng)未見細菌生長，但細菌遺傳物質(zhì)不斷被檢出，且兩者間有統(tǒng)計學差異，抗生素的抑制作用、細菌生物活性改變、死亡細菌的遺傳物質(zhì)殘留都會導致這種差異，有待進一步驗證細菌活性、毒性和基因分型等。

關節(jié)液內(nèi)無血液，無法形成有效抗菌環(huán)境，當內(nèi)環(huán)境適宜時殘留的細菌和死亡細菌的遺傳物質(zhì)會再次成為危險因素。新的細菌定植時，致病因子的基因通過轉座作用整合在新細菌體內(nèi)，如一些細菌形成菌膜的能力和一些細菌耐藥性的獲得是通過鞭毛交換遺傳物質(zhì)實現(xiàn)的，因此局部大量檢出金葡菌遺傳物質(zhì)亦為危險因素[21-23]。即使是遺傳物質(zhì)本身，再次入血也會導致超敏反應發(fā)生。

時序檢測證實細菌的遺傳物質(zhì)檢出率隨時間延長而急劇下降，且細菌培養(yǎng)的陽性率也有所下降，作 者推測與輸液港的沖洗作用和組織的代謝密切相關，增加手術間隔對提高翻修手術的成功率非常有意義。本實驗中1只持續(xù)細菌培養(yǎng)陽性可能與清創(chuàng)不徹底、間隙內(nèi)細菌殘留并持續(xù)釋放有關，臨床指標持續(xù)不下降應考慮穿刺或灌洗培養(yǎng)，只要細菌培養(yǎng)陽性應盡快二次清創(chuàng)，并徹底尋找隱藏細菌[24]。

綜上所述，關節(jié)翻修術后細菌在關節(jié)腔內(nèi)的分布非常復雜，一期清創(chuàng)手術的選擇應非常慎重；遺傳物質(zhì)的殘存作為潛在危險因素可帶來臨床癥狀，遺傳物質(zhì)殘存在感染復發(fā)和細菌變異中的作用值得深入研究。

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