黃 亮 ，王光偉,，楊俊梅，熊元元，劉志雄，劉運生，任凱群,，何鐵勇，向雙林，張 健

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院，湖南 長沙 410081；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長沙 410008）

KCTD10（potassium channel tetramerisation domain-containing 10）基因定位于人類染色體的12q24.11，有7 個外顯子，屬于PDIP1 基因家族，該家族基因高度同源，主要包括TNFAIP1、PDIP1和KCTD10 等基因[1]。這些基因可能在TNF-α 信號通路、DNA 合成和細胞凋亡中起到了重要的作用[1-3]。本研究擬通過免疫組織化學(xué)的方法，檢測KCTD10 在正常腦膜及上皮型腦膜瘤標(biāo)本中表達水平的差異，為進一步研究其在腦膜瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

腦膜瘤標(biāo)本均為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科腫瘤切除手術(shù)標(biāo)本，在手術(shù)之前均未進行任何放療、化療及免疫治療等特殊處理。所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查，均為上皮細胞型腦膜瘤。取3例來源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科凸面腦膜瘤患者手術(shù)時取出的腦膜組織作正常對照。所有標(biāo)本均已切除出血、壞死和電灼的組織，生理鹽水沖洗干凈后，4%多聚甲醛固定。

1.2 主要儀器和試劑

石蠟包埋機、Leica 石蠟切片機、Olympus 光學(xué)顯微鏡、冰箱；KCTD10 抗體購自南京川博公司，免疫組織化學(xué)所用二抗和DAB 試劑盒均購自福建邁新公司。

1.3 免疫組化染色

將置于4%的多聚甲醛液中的腦膜瘤標(biāo)本取出，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度2 μm，然后脫蠟及水化，將切片置于檸檬酸抗原修復(fù)液高壓修復(fù)，用PBS 沖洗切片3 次，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS 沖洗切片3 次，加一抗（兔抗人KCTD10 抗體）4℃過夜，PBS 沖洗3 次后加1 滴即用型MaxVisionTM 試劑，室溫下孵育15 min。PBS 沖洗3 次，加2 滴新鮮配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察3-5 min，終止顯色，蘇木素復(fù)染封片。以一抗稀釋溶液代替一抗作陰性對照。

1.4 細胞學(xué)觀察

KCTD10 蛋白免疫組化陽性染色結(jié)果應(yīng)為細胞漿和（或）細胞膜呈棕黃色或棕褐色著色。隨機選取10 個高倍鏡視野，參照Lizasa T的方法進行評分，陽性細胞百分比：無表達為0，1%～25%為1，25%～50%為2，超過50%為3；著色強度：無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3，兩者分值相加為最后得分：0 分為陰性，2 分為（+），3～4 分為（++），5～6 分為（+++）。

2 結(jié)果

KCTD10 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖1、2、3所示，KCTD10 蛋白陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒，主要位于胞漿，同時在細胞漿膜也有表達。免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示KCTD10 蛋白在所有上皮型腦膜瘤標(biāo)本中高表達，4例上皮型腦膜瘤標(biāo)本中，有1例KCTD10表達的為（+++）（5 分），3例為（++）（4 分）；而在3例正常腦膜標(biāo)本中都沒有檢測到KCTD10的表達。

圖1.正常腦膜組織中KCTD10的表達（SABC 法，左圖×200，右圖×400）

圖2.上皮型腦膜瘤 陰性對照（SABC 法，左圖×200，右圖×400）

圖3.上皮型腦膜瘤組織中KCTD10的表達（SABC 法，左圖×200，右圖×400）

3 討論

腦膜瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的一種原發(fā)腫瘤，占原發(fā)顱內(nèi)腫瘤的13%～19%[4]。WHO 將腦膜瘤分為三級15 個亞型：其中9 種屬Ⅰ級（良性）、3種屬Ⅱ級（低度惡性）、3 種為Ⅲ級（惡性）。上皮型腦膜瘤屬于Ⅰ級。腦膜瘤的治療主要是手術(shù)切除腫瘤。隨著神經(jīng)外科技術(shù)的發(fā)展，腦膜瘤手術(shù)的全切率已明顯提高，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，且某些特殊部位的腦膜瘤仍無法做到全部切除。因此，亟需從分子生物學(xué)水平對腦膜瘤的發(fā)生機制深入研究，以便為腦膜瘤的診斷和治療提供新的方法。腦膜瘤的發(fā)生可能與外傷、病毒感染、激素、生長因子等多種因素有關(guān)。近年來，關(guān)于腦膜瘤生長、轉(zhuǎn)移的因素和機制的研究取得了一些重要的成果，發(fā)現(xiàn)了諸如尿激酶型纖維酶原激活物、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、survivin蛋白、VEGF、P53 等與腦膜瘤的惡變、侵襲過程有關(guān)[5-6]，但腦膜瘤發(fā)生的分子機制仍遠未得到闡明，故有必要深入研究其作用機制。

KCTD10 與PDIP1 在氨基酸序列上高度保守，在N 端區(qū)域，都有一個BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域，而在C 端區(qū)域則是PCNA的結(jié)合模體[1]。有研究表明，在人肺癌細胞系A(chǔ)549 細胞中，降低KCTD10的表達會抑制細胞的增殖[7]。在大鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)CTD10和PDIP1 都可以受腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6）的誘導(dǎo)，都能與PCNA和DNA 聚合酶δ的小亞基有相互作用，能夠激活依賴PCNA的DNA聚合酶δ的活性[3]。TNF-α 是一種多效細胞因子，它在細胞凋亡、細胞增殖等許多細胞生理過程中起重要作用[8]。在許多惡性腫瘤細胞中TNF-α 可以誘導(dǎo)細胞的生長抑制，但在某些細胞系中又可以促進成活和繁殖。PCNA 又稱周期素，是一種多功能蛋白，通過與其他蛋白因子的相互作用，在DNA 復(fù)制、DNA 修復(fù)和細胞周期調(diào)控等一系列細胞生理過程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究結(jié)果表明，在上皮型腦膜瘤中KCTD10高表達，而在正常的腦膜組織中無表達，這一結(jié)果提示KCTD10 在上皮型腦膜瘤的發(fā)生中起到了某種作用。有研究表明PCNA 在腦膜瘤中的的表達顯著高于正常的腦組織[9]。結(jié)合本研究的結(jié)果，推測KCTD10 可能是通過PCNA 介導(dǎo)的信號通路在上皮型腦膜瘤的發(fā)生中起作用的。

本研究從組織水平初步檢測了上皮型腦膜瘤中KCTD10的表達情況，基于以上的研究結(jié)果，本課題組擬收集更多的上皮型腦膜瘤標(biāo)本，進一步確認(rèn)上皮型腦膜瘤中KCTD10的表達情況，并在其他類型的腦膜瘤標(biāo)中檢測KCTD10的表達情況，結(jié)合細胞學(xué)實驗確認(rèn)、證實KCTD10 在腦膜瘤發(fā)生發(fā)展中的作用與具體機制，為腦膜瘤的診斷和治療提供新的線索。

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