張慧宇，郭敏芳，劉 華，張艷霞

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，山西大同037009）

高血糖條件下神經(jīng)降壓素調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

張慧宇1，郭敏芳2，劉 華2，張艷霞2

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，山西大同037009）

目的觀察神經(jīng)降壓素在高血糖條件下對巨噬細(xì)胞的影響。方法取昆明小鼠脾巨噬細(xì)胞，高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)15 d，細(xì)胞分PBS對照組和神經(jīng)降壓素干預(yù)組。ELISA檢測法檢測TNF-、IL-1β及IL-6的釋放；RT-PCR檢測TNF-、IL-1β及IL-6mRNA的表達(dá)。結(jié)果高糖條件下神經(jīng)降壓素能降低巨噬細(xì)胞TNF-、IL-1β及IL-6的釋放和mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論在高糖條件下，神經(jīng)降壓素可以通過抑制炎性細(xì)胞因子的釋放影響巨噬細(xì)胞的反應(yīng)。

高血糖；神經(jīng)降壓素；巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)

糖尿病的特點(diǎn)是血糖的動(dòng)態(tài)平衡受損，在世界上影響著數(shù)以百萬計(jì)的人[1]。糖尿病可以導(dǎo)致四肢的血液循環(huán)不良，特別是在有神經(jīng)病變的人，長期的糖尿病能破壞免疫系統(tǒng)，增加患者感染率的發(fā)生，其中慢性足潰瘍是糖尿病最常見、最有代表性的并發(fā)癥之一，這種疾病影響的糖尿病人口約15％[2]。糖尿病足潰瘍可以減少體力活動(dòng)，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致下肢截肢。事實(shí)上，與糖尿病患者高血糖并發(fā)的有白細(xì)胞功能受損[3]，有研究發(fā)現(xiàn)，通過給胰島素使血糖水平正常化可以改善并最終恢復(fù)中性粒細(xì)胞的活性和功能[4]。糖尿病創(chuàng)面組織中炎性細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的失衡影響炎癥反應(yīng)以及隨后的愈合過程[5]，而巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)反應(yīng)的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

研究表明，在創(chuàng)面修復(fù)反應(yīng)過程中，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)傷口愈合，特別是通過神經(jīng)肽，比如P物質(zhì)和神經(jīng)降壓素[6]。神經(jīng)降壓素具有廣泛的生物學(xué)功能，它可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，因?yàn)樗芘c白細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞相互作用，刺激細(xì)胞因子的釋放和趨化，特別是在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能過程中發(fā)揮著重要的作用[7]。此研究的目的主要觀察神經(jīng)降壓素在高血糖條件下對巨噬細(xì)胞的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

昆明小鼠取自山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心；神經(jīng)降壓素購自Sigma公司；Trizol試劑購自Gibco-BRL公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA測定試劑盒購自Pepro Tech公司；GADPH、TNF-α、IL-1β和IL-6引物由生工生物提供；MTT試劑購自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco-BRL公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

無菌條件下處死昆明小鼠并分離脾臟，40μm濾網(wǎng)研磨脾臟制備細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心，然后裂解紅細(xì)胞，PBS洗3次，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，棄掉不貼壁的T淋巴細(xì)胞，貼壁的即為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在含有30μm ol/L的D-葡糖糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d，然后干預(yù)組加10 n mol/L的神經(jīng)降壓素，對照組加等量的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的檢測

收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上讀取不同濃度TNF-α、IL-1β和IL-6標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的光密度值（A450），繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后參照各細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，結(jié)果以pg/mL計(jì)量。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)

收集用Trizol法提取的細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測定A260/A280為1.8～2.0，證實(shí)RNA純度符合RT-PCR反應(yīng)要求。以總RNA為模板，用Oligo-d（T）18為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，特異性引物分別擴(kuò)增 TNF-α、IL-1β、IL-6和GADPH。TNF-α引物序列為上游5＇-CAAGGGACTAGCCAGGAG-3＇，下游 5＇-TGCCTCTTCTGCCAGTTC-3＇；IL-1β引物序列為上游5＇-ACCTGTCCTGTGTAATGAAAG-3＇，下游5＇-GCTTGTGCTCTGCTTGTG-3＇；IL-6引物序列為上游5＇-TTCCATCCAGTTGCCTTC-3＇，下游 5＇-TTCTCATTTCCACGATTTCC-3＇；GADPH引物序列為上游5＇-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTG-3＇，下游5＇-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3＇。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性15min，94℃變性15 s，60℃退火25 s，72℃延伸20 s，共55個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min，1.5％瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Qautity One軟件分析iNOS和TLR4與GADPH的PCR產(chǎn)物灰度值，以二者比值來表示TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 高糖條件下NT抑制巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放

采用ELISA法測定巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6（圖1），結(jié)果顯示NT降低高糖條件下巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α、IL-1β和IL-6，比對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，NT在高糖條件下抑制巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

圖1 ELISA檢測NT對高糖條件下巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，IL-1β和IL-6的影響

2.2 高糖條件下NT降低巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)

提取細(xì)胞RNA，采用RT-PCR法檢測巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá) （圖2），結(jié)果表明高糖條件下NT抑制巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)，比對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與ELISA結(jié)果相一致。

圖2 RT-PCR檢測NT對高糖條件下巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA的影響

3 討論

血小板、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、白介素和生長因子促進(jìn)傷口的愈合，這些重要的細(xì)胞介質(zhì)調(diào)節(jié)愈合階段的炎癥反應(yīng)，特別是巨噬細(xì)胞在炎癥和免疫過程中發(fā)揮重要作用。生理和病理事件可以被激活，并最終被神經(jīng)肽調(diào)節(jié)，比如P物質(zhì)和神經(jīng)降壓素[8]。

在高糖條件下，巨噬細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子的模式會(huì)被影響。糖尿病能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞多種細(xì)胞因子的表達(dá)，比如TNF-α和IL-6[9]。IL-6由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，并作為一個(gè)促炎性細(xì)胞因子刺激免疫反應(yīng)。TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的一種重要炎性細(xì)胞因子，并且單核細(xì)胞中有低水平的表達(dá)。IL-1β是由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)過程中重要的介質(zhì)，它參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡[10]。

神經(jīng)降壓素是廣泛分布于腦組織和胃腸道的生物活性肽，能調(diào)節(jié)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，比如胃腸道系統(tǒng)和肺的炎癥反應(yīng)過程，它可以通過和巨噬細(xì)胞直接作用而抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和iNOS的表達(dá)，證明神經(jīng)降壓素在炎癥時(shí)有一定的保護(hù)作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中，在30mmol/L葡糖糖條件下，NT能使巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達(dá)降低，說明在高糖條件下，NT通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)，這些影響有可能在糖尿病患者的傷口愈合過程中是有益的。

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〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

The Experimental Study of Neurotensin M odulating the Inflammatory Response of M acrophages under Hyperglycem ic Conditions

ZHANG Hui－yu1，GUO Min－fang2，LIU Hua2，ZHANG Yan－xia2
（1.Departmentof Traditional Chinese Medicine，Medical School of ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009；2.Department of Histology and Embryology，Medical School of ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009）

Objective To observe the effect of Neurotensin（NT）in macrophages function under hyperglycemic conditions.Methods Macrophageswere prepared from spleen of Kunmingmice and incubated in 30μmM（high glucose）D－glucose，for 15 days.The cells were divided into the PBS control group and Neurotensin treatment group.The level of TNF－α、IL－1βand IL－6 was detected by ELISA；ThemRNA expressions of TNF-α、IL-1βand IL-6 were detected using RT-PCR.Results：NT can decrease the release of TNF-α、IL-1βand IL-6 inmacrophages under hyperglycemic conditions（P＜0.05）.Conclusion These studies demonstrate that NT through the regulation of inflammatory cytokine expression affectsmacrophage responses.

hyperglycemic；neurotensin；inflammatory response ofmacrophages

R587.1；R392.1

A

1674-0874（2013）06-0042-04

2013-08-08

山西大同大學(xué)2011年度青年科學(xué)研究基金項(xiàng)目［2011Q13］

張慧宇（1979-），男，山西原平人，碩士，助教，研究方向：中醫(yī)臨床。