穆雅琴，劉潤花，朱壯彥，劉麗華，孟 燕，趙富璽

（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，山西大同037009）

乙酰肝素酶與人類復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系研究

穆雅琴，劉潤花，朱壯彥，劉麗華，孟 燕，趙富璽*

（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，山西大同037009）

目的 研究乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）與人類早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系，進(jìn)一步探討HPSE在自然流產(chǎn)過程中所起的作用。方法 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)選取的非意愿性正常妊娠者和早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)者絨毛組織中HPSE的表達(dá)情況。結(jié)果 正常妊娠組的HPSE表達(dá)率明顯高于復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論在正常妊娠過程中HPSE表達(dá)增高，促進(jìn)正常胚泡的植入，而復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中HPSE表達(dá)降低會(huì)影響胚泡的植入，導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；HPSE；免疫組化

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，占全部妊娠的0.4％~0.8％[1]，是一種妊娠期常見的并發(fā)癥，其病因復(fù)雜多樣，與患者自身的遺傳、解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌、免疫、感染等因素有關(guān)，但仍有部分原因不明[2-3]，它已成為目前生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

妊娠是成功的半同種移植過程，妊娠過程任何異常均可能導(dǎo)致流產(chǎn)。其中母體與胚胎之間的相互作用更是如此。胚泡成功植入子宮是妊娠的關(guān)鍵，它需要正常發(fā)育的胚泡和子宮內(nèi)膜之間和諧的相互作用，這受到多種因素的影響。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是子宮細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，正常情況下可以保護(hù)子宮內(nèi)膜免受感染等侵襲，但在胚胎植入過程中則被降解，以利于胚胎植入和血管形成。目前發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）是體內(nèi)唯一可以降解硫酸類肝素蛋白聚糖的酶。

本研究采用免疫組化方法，檢測(cè)正常妊娠和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)婦女的流產(chǎn)絨毛組織中HPSE的表達(dá)水平，分析HPSE與自然流產(chǎn)的關(guān)系，研究HPSE在人類正常妊娠和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

實(shí)驗(yàn)病例選自大同市第一人民醫(yī)院2011-2012年門診及住院患者，選取非意愿性正常妊娠者流產(chǎn)絨毛組織15例，早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)者流產(chǎn)絨毛組織20例，正常組孕婦平均年齡（28.4±5.4）歲，平均孕周為（8.6±3.7）周，B超證實(shí)胎兒發(fā)育正常，既往無不良妊娠史。自然流產(chǎn)組孕婦平均年齡（27.5±3.9）歲，平均孕周為（8.9±2.5）周。2組之間年齡、孕周等一般資料間經(jīng)檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有對(duì)象平素月經(jīng)規(guī)則，近期未服用過激素類藥物，均排除全身及生殖系統(tǒng)急、慢性感染。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的相應(yīng)要求，所有對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

HPSE抗體購自以色列InSight生物制藥公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

標(biāo)本以中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4~5 μm連續(xù)切片。標(biāo)本按試劑盒要求程序作HPSE免疫組化染色。顯微鏡下觀察，胞漿為棕黃色染色者為陽性細(xì)胞。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照；以已知的HPSE標(biāo)本作為陽性對(duì)照。

用Qwin圖像分析系統(tǒng)對(duì)HPSE的免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行灰度值檢測(cè)?；叶戎翟礁呙庖呓M織化學(xué)染色越強(qiáng)，染色越強(qiáng)則蛋白表達(dá)越高；灰度值越低免疫組織化學(xué)染色越弱，染色越弱則蛋白表達(dá)越低。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （xˉ±s）表示，采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

所有切片免疫組化染色背景清晰，陰性對(duì)照不著色。HPSE陽性染色為鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒，染色明顯高于背景。染色結(jié)果顯示：正常妊娠組的絨毛組織中HPSE表達(dá)的灰度值為（163.09±43.61），自然流產(chǎn)組絨毛組織中HPSE表達(dá)的灰度值為（132.68±29.69），前者的水平和強(qiáng)度明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.46，P=0.019 5）。

圖1 HPSE蛋白的免疫組化染色結(jié)果（×400）

3 討論

胚泡在子宮內(nèi)膜的植入開始于滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜之間直接的細(xì)胞接觸，這一過程與細(xì)胞外基質(zhì)重建有密切關(guān)系。在胚泡植入過程中，子宮基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化，同時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入，通過發(fā)揮類似腫瘤細(xì)胞浸潤的特性，導(dǎo)致子宮細(xì)胞外基質(zhì)改造和母體血管重建。而構(gòu)成子宮細(xì)胞表面、細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的重要組成部分之一就是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一能降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的β-D-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶是HPSE，它可識(shí)別硫酸乙酰肝素側(cè)鏈的HS，將HS降解為10～20個(gè)糖單位大小的短糖鏈。已被證實(shí)在許多組織和細(xì)胞中都存在HPES，其中包括胎盤、免疫細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和胚胎毛細(xì)血管的子宮內(nèi)膜。HPES可以破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的結(jié)構(gòu)和完整性，降低其保護(hù)作用；還可以釋放一些相關(guān)因子調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入、血管生成和組織重建[4-5]。

本研究發(fā)現(xiàn)在正常妊娠組的絨毛組織中有大量HPSE表達(dá)，而復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)組的絨毛中HPSE的表達(dá)很弱，兩組比較有明顯差異。在正常妊娠中，HPSE在絨毛組織中大量表達(dá)，通過裂解HS對(duì)血管生成產(chǎn)生影響，為胚胎組織的植入、生長(zhǎng)、滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤和胎盤血管的形成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，從而促進(jìn)胚泡的植入和胎兒的成長(zhǎng)。但在復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中，HPSE的低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)不能充分降解，子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，不利于滋養(yǎng)層細(xì)胞植入；同時(shí)通過裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖產(chǎn)生的細(xì)胞因子少，使得血管生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂受到抑制。而且胚胎作為一個(gè)半同種移植物，正常情況下會(huì)在母胎界面誘發(fā)免疫耐受，保護(hù)胎兒，而HPSE的減少也會(huì)影響對(duì)T細(xì)胞的免疫耐受的形成，從而增強(qiáng)母胎界面的細(xì)胞免疫的發(fā)生[6-7]。有研究表明在轉(zhuǎn)基因小鼠中，HPSE高表達(dá)可導(dǎo)致胚胎植入數(shù)量的大幅度增加[8]。而且在體外研究中發(fā)現(xiàn)，大量的HPSE可提高胚胎的植入數(shù)量、促進(jìn)胚胎的生長(zhǎng)[9]。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)論一致，因此我們認(rèn)為母胎界面低表達(dá)HPSE可能也是導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生的原因之一。更好地了解植入與胚胎生長(zhǎng)的有關(guān)的分子機(jī)制，將有助于進(jìn)一步指導(dǎo)早期自然流產(chǎn)的治療。

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〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

The Association of the HPSE in the Villus of the Human Spontaneous Abortion

MU Ya-qin，LIU Run-hua，ZHU Zhuang-yan，LIU Li-hua，MENG Yan，ZHAO Fu-xi
（Immunology Institute，Medical School of ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009）

Objective To investigate the relationship between HPSE and recurrent spontaneous abortion.Methods By using immunohistochemical methods we determined the expression of HPSE in the villus of the human normal pregnancy and recurrent spontaneous abortion.Results The expressions of HPSE in the normal group were significantly increased in comparison with that in the spontaneous abortion group （P＜0.05）.Conclusions The HPSE participates in the procedure of normal pregnancy，and the lower experssion of HPSEmay lead to the spontaneous abortion.

recurrent spontaneous abortion；HPSE；immunohistochemicalmethods

R714.21

A

1674－0874（2013）06－0038－02

2013－07－12

山西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目［2010021036－4］；國家人口計(jì)生委資助項(xiàng)目［C－73］；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目［81170621/H0425］

穆雅琴（1980－），女，山西原平人，碩士，講師，研究方向：生殖免疫；*趙富璽，男，博士，教授，通信作者。