張 梁，元輝雄，黃永秩

(1.廣西右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 百色 533000;2.廣西右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，廣西 百色 533000)

肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor-4alpha，HNF4α)屬于核受體超家族成員之一，是一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子，在生長發(fā)育、代謝和疾病中控制著許多基因的表達[1]。HNF4α在人體肝、腎、心、脾、腸等器官中均有表達[2]，至今已有許多關于其參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的報道，但HNF4α在結(jié)直腸癌中的表達及其作用的研究報道較少[3-6]，其研究結(jié)果也存在較大差異。為此，本研究采用免疫組化方法，對HNF4α在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的細胞內(nèi)定位及表達進行檢測，探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

材料和方法

一、病例和材料

收集右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院2008年3月至2011年3月行手術治療的結(jié)直腸癌患者132例，其中男83例，女49例，年齡43～71歲。高分化11例，中分化31例，低分化90例;臨床Dukes分期，A期19例，B期27例，C期56例，D期30例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移79例。所有病例術前未采用任何放化療或生物治療，標本均經(jīng)病理學診斷證實。取癌組織和配對癌旁正常組織(經(jīng)病理學診斷證實[7]的正常組織，距腫瘤邊緣約5 cm)各132份。

二、試劑與檢測方法

HNF4α石蠟切片的免疫組化染色采用Santa Cruz公司Immuno CruzTMstaining system SP法免疫組化試劑盒產(chǎn)品，HNF4α抗體為羊來源的多克隆抗體，工作濃度為 1∶75，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗進行空白對照，HNF4α陰性對照加試劑盒附帶的正常羊血清。

三、免疫組化結(jié)果判定

以出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽性，計分標準:Ⅰ類根據(jù)染色細胞總數(shù)，＜5%為0分，5% ～25%為1分，25% ～50%為2分，＞50%為3分 ;Ⅱ類根據(jù)著色強度，細胞染色呈陰性為0分，呈淡黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈棕褐色為3分。Ⅰ類與Ⅱ類分數(shù)相加的總分作為判斷結(jié)果，總分為0視為陰性(－)，1～2為弱陽性(+)，3～4為中等陽性(++)，5～6為強陽性(+++)。每張切片隨機抽取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算平均得分作為最終結(jié)果[3]。

四、統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

結(jié) 果

一、HNF4α蛋白的表達及細胞內(nèi)定位

免疫組化結(jié)果顯示，HNF4α蛋白分子的表達定位于細胞漿或細胞核，呈棕黃色。結(jié)直腸癌組織細胞漿中HNF4α表達陽性率為76.5%，而癌旁正常組織細胞漿中 HNF4α表達陽性率為3.8%;結(jié)直腸癌組織細胞核中HNF4α表達陽性率為12.9%，而癌旁正常組織細胞核中HNF4α表達陽性率為64.4%。與癌旁正常組織相比，結(jié)直腸癌組織細胞漿和細胞核中HNF4α的表達陽性率差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=145.3，χ2=73.9，P ＜0.05)。見表1。

表1 HNF4α在結(jié)直腸癌組織及相應的癌旁正常組織中的細胞內(nèi)定位[例(%)]

二、HNF4α蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征間的關系

細胞漿中HNF4α蛋白表達陽性率在不同腫瘤分化程度、Dukes分期間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02、P=0.03);與患者性別、年齡(≥55 歲或＜55歲)、腫瘤位置、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征無明顯相關性(P均＞0.05)。見表2。

表2 細胞漿HNF4α表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系

討 論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有逐年上升的趨勢[3]，但其發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多環(huán)節(jié)、多因素、多分子參與的復雜過程。HNF4α是一種核轉(zhuǎn)錄因子，對物質(zhì)代謝及細胞分化的許多基因都起著重要的調(diào)節(jié)作用，在惡性腫瘤中扮演重要角色，已有研究證明HNF4α具有抑制肝細胞癌的作用[4]。近年來HNF4α與結(jié)直腸腫瘤的關系日益受到重視，但HNF4α在結(jié)直腸腫瘤的表達及其意義一直存在爭議。

Schwartz等[8]通過配體拮抗劑抑制 HNF4α的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞的生長被抑制，HNF4α具有促進腫瘤形成的作用。Darsigny等[4]通過 ApcMin小鼠的對比實驗發(fā)現(xiàn)，缺乏HNF4α時腸腫瘤被抑制，也說明HNF4α能促進腸腫瘤形成。而寧北芳[9]對大鼠的研究則表明，HNF4α具有抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤生長的作用。Chellappa等[5]通過研究HNF4α的啟動子亞型發(fā)現(xiàn)，近80%結(jié)腸癌樣本的核HNF4α P1啟動子亞型是缺失的，核HNF4α表達的缺失，可能是結(jié)腸癌的早期跡象，核HNF4α具有預防結(jié)腸癌的作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織細胞漿中HNF4α的表達顯著高于癌旁正常組織，而細胞核中的表達顯著低于癌旁正常組織，結(jié)合Chellappa等[5]的研究結(jié)果分析，可能是由于結(jié)直腸癌組織中的Src酪氨酸激酶使細胞核內(nèi)的HNF4α磷酸化，在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ligand binding domain，LBD)的磷酸化模擬突變(phosphomimetic mutants)又使磷酸化的HNF4α蛋白的穩(wěn)定性、核表達和轉(zhuǎn)活功能下降;而HNF4α的表達與Fas配體的表達直接相關[10]，HNF4α 表達減少，F(xiàn)as配體的表達也相應減少，使Fas配體的促癌細胞凋亡及阻止癌細胞遷移的作用減弱，結(jié)直腸組織細胞的惡變因此而未能受到抑制，導致結(jié)直腸癌的發(fā)生。而結(jié)直腸組織HNF4α的細胞內(nèi)定位異常的機制目前尚不明了，有待更深入的研究。

進一步分析結(jié)直腸癌組織細胞漿中HNF4α的表達與臨床病理特征的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織細胞漿中HNF4α表達與患者的年齡、性別、腫瘤部位無明顯相關性，而與分化程度和Dukes分期密切相關，因而可為結(jié)直腸癌的診斷及預后提供客觀依據(jù)?？赡苡捎跇颖玖科伲狙芯可胁蛔阋宰C實HNF4α與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系，因此HNF4α與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關系尚需更深入的研究。

[1]Weltmeier F，Borlak J.A high resolution genome-wide scan of HNF4α recognition sites infers a regulatory gene network in colon cancer[J].PLoS One，2011，6(7):e21667.

[2]龍 云，唐 紅，劉 聰，等.肝細胞核因子4α和3β在人主要器官中的表達[J].世界華人消化雜志，2006，14(25):2504-2509.

[3]趙楚雄，魏宜勝，林秀娟.HNF-4α在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義[J].廣東醫(yī)學，2011，32(9):1125-1127.

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[5]Chellappa K，Jankova L，Schnabl JM，et al.Src tyrosine kinase phosphorylation of nuclear receptor HNF4α correlates with isoform-specific loss of HNF4α in human colon cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(7):2302-2307.

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[7]陳金旭，韓 英.利用原子力顯微鏡觀察大腸癌細胞與癌旁正常組織細胞[J].中國醫(yī)療前沿，2012，7(1):17-18.

[8]Schwartz B，Algamas-Dimantov A，Hertz R，et al.Inhibition of colorectal cancer by targeting hepatocyte nuclear factor-4alpha[J].Int J Cancer，2009，124(5):1081-1089.

[9]寧北芳.肝細胞核因子4α預防大鼠肝癌及其分子機制研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學，2009.

[10]Osanai M，Chiba H，Kojima T，Hepatocyte nuclear factor(HNF)-4alpha induces expression of endothelial Fas ligand(FasL)to prevent cancer cell transmigration:a novel defense mechanism of endothelium against cancer metastasis[J].Jpn J Cancer Res，2002，93(5):532-541.