葉 蕓， 李蘇亮， 姜 萍， 王 瑤， 楊 超

(西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西 西安 710077)

肺炎支原體(Mp)是兒童和青少年社區(qū)獲得性呼吸道感染的常見病原體之一，其導(dǎo)致的肺炎及肺外并發(fā)癥對兒童健康危害嚴(yán)重[1-2]。Mp缺乏細(xì)胞壁，故對作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物如青霉素類、頭孢菌素類不敏感，而對影響細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的抗菌藥物如大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類等敏感[3]。由于兒童處于生長發(fā)育期，能夠用于治療兒童Mp感染的藥物選擇更少，首選大環(huán)內(nèi)酯類藥物，主要為14元環(huán)的紅霉素和15元環(huán)的阿奇霉素。近年來已有多個(gè)國家報(bào)道了Mp紅霉素耐藥株的出現(xiàn)[4-5]。目前耐藥機(jī)制的研究熱點(diǎn)主要為大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物作用靶位的基因突變。我國也有Mp耐藥株的報(bào)道，且耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，造成有效抗菌藥物失效。但對于肺炎支原體23SrRNA基因突變位點(diǎn)與耐藥表型之間的關(guān)系缺乏系統(tǒng)研究。為了解本地區(qū)社區(qū)呼吸道感染肺炎支原體感染狀況及進(jìn)一步明確Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制及基因突變位點(diǎn)與耐藥表型之間的關(guān)系，我們從臨床分離培養(yǎng)的Mp中篩選耐藥株，并對23SrRNA藥物作用靶位基因進(jìn)行檢測，系統(tǒng)分析肺炎支原體23SrRNA基因突變位點(diǎn)與耐藥表型之間的關(guān)系。

材料和方法

一、對象

研究對象為2008年6月至2010年6月西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科社區(qū)獲得性呼吸道感染患兒400例，男250例，女150例，年齡1～12歲。

二、方法

1.Mp培養(yǎng)基制備 在70 mL支原體(PPLO)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入新生小牛血清20 mL、50%鮮酵母浸液5 mL、1%酚紅指示劑200μL、20%葡萄糖2.5 mL、2.5%醋酸鉈 1 mL、200000 U/mL 青霉素0.5 mL。新鮮小牛血清由鄭州益康生物有限公司生產(chǎn);鮮酵母由博而特生物科技有限公司提供;酚紅指示劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;抗菌藥物購自深圳致君制藥有限公司。

2.標(biāo)本采集及培養(yǎng) 用滅菌棉簽擦拭感染期患兒咽后壁分泌物，經(jīng)處理后接種于Mp培養(yǎng)基中，混勻后置37℃溫箱中孵育，并設(shè)置陰性與陽性對照。如果有Mp生長，將發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基pH值下降，指示劑發(fā)生顏色變化，并與陽性對照做對比。顏色由紅變黃可作為有Mp生長的指征。

3.Mp臨床分離株的分子鑒定 Mp聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)熒光探針法定量檢測試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。

4.體外藥物敏感試驗(yàn) 按照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)判定每株對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的敏感性，采用微量稀釋法測定臨床分離株的最小抑菌濃度(MIC)[6-7]。用Mp液體培養(yǎng)基倍比稀釋藥物，從256 mg/L稀釋至0.001 mg/L。各管中加入等量菌液(質(zhì)量濃度為1×108CCU/L)，置于37℃二氧化碳溫箱孵育。8種藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國藥品生物制品檢定所，其中14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物包括紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素，16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物包括交沙霉素、麥迪霉素、泰利霉素、螺旋霉素，15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物為阿奇霉素。Mp標(biāo)準(zhǔn)株 M129作為質(zhì)控菌株，凡是MIC值超出標(biāo)準(zhǔn)株MIC值4倍以上，將其判為耐藥。

5.提取臨床分離株DNA 將冷凍保存的Mp菌株取出后傳代復(fù)蘇。當(dāng)生長時(shí)間較穩(wěn)定后(約7 d)，吸取 20 μL 菌液置于 1.5 mL 離心管中，以13000×g離心10 min，棄去上清液后，然加標(biāo)本處理液 200 μL并混勻，在 100℃沸水中水浴10 min，此溶液作為DNA模板備用。

6.PCR擴(kuò)增目的基因片段及 DNA測序 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的Mp 23S rRNA核酸序列(NC_000912)利用生物學(xué)軟件Primer 5.0自行設(shè)計(jì)巢式PCR擴(kuò)增所需的引物，見表1。擴(kuò)增體系為:Mp-1F和Mp-1R引物各15 pmol，TaqDNA聚合酶 1 U，總反應(yīng)體積 20 μL，其中模板液 5 μL。熱循環(huán)參數(shù)為93℃預(yù)變性2 min、93℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)72℃延長5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物為290 bp。然后取2 μL作為模板繼續(xù)進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，用Mp-2F和Mp-2R作為引物，其余條件相同，完成第2次擴(kuò)增。擴(kuò)增終產(chǎn)物為244 bp并對其進(jìn)行電泳，檢測是否存在目的片段。對于經(jīng)電泳檢測陽性的標(biāo)本，將過夜培養(yǎng)的菌液直接取1 mL放離心管中送往上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測得序列與NCBI已登錄的Mp標(biāo)準(zhǔn)株M129(ATCC 29342D)相應(yīng)基因序列作比對，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陽性和陰性對照[7-8]。

表1 巢式PCR擴(kuò)增引物及產(chǎn)物大小

結(jié) 果

一、Mp的分離培養(yǎng)及分子鑒定

400份咽拭子標(biāo)本共分離培養(yǎng)出Mp 50株，分離陽性率為12.5%。應(yīng)用PCR熒光探針法定量檢測證實(shí)均為Mp。

二、體外藥物敏感試驗(yàn)檢測結(jié)果

按照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)，對分離培養(yǎng)陽性的50株Mp及標(biāo)準(zhǔn)株M129進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)，判定時(shí)間為5～14 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中32株(64%)敏感，18株(36%)耐藥。見表2。

表2 32株敏感株的MIC (μg/mL)

三、巢式PCR擴(kuò)增和DNA測序結(jié)果

1.產(chǎn)物電泳 巢式PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的目的條帶見圖1。

2.DNA測序 敏感株與耐藥株的DNA測序結(jié)果見圖2～5。

四、突變位點(diǎn)與耐藥株體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對分離培養(yǎng)陽性的50株Mp及標(biāo)準(zhǔn)株M129進(jìn)行測序分析，其中32株敏感株與標(biāo)準(zhǔn)株M129比較均未發(fā)生基因位點(diǎn)突變。18株耐藥株分別出現(xiàn)A2063G(12/16)、A2064G(3/16)、A2067G(1/16)位點(diǎn)突變，且以A2063G為主(約占75%)，有2株耐藥菌株無基因位點(diǎn)的突變。A2063G突變株表現(xiàn)為對14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥，A2064G突變株表現(xiàn)為對14、16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥，A2067G突變株表現(xiàn)為對交沙霉素耐藥。見表3。

圖1 巢式PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 Mp敏感株基因測序圖(無點(diǎn)突變)

圖3 Mp耐藥株2063位點(diǎn)突變測序圖

圖4 Mp耐藥株2064位點(diǎn)突變測序圖

圖5 Mp耐藥株2067位點(diǎn)突變測序圖

表3 18株耐藥株體外藥物敏感試驗(yàn)檢測結(jié)果與突變位點(diǎn)結(jié)果

討 論

Mp近年來感染呈加重趨勢，所導(dǎo)致的肺炎和肺外并發(fā)癥對兒童健康危害嚴(yán)重[8-10]。鑒于其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和兒童處于生長發(fā)育期的特殊性，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物成為治療兒童Mp感染的首選藥物。大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮抑菌作用。作用靶位是細(xì)菌核糖體50S大亞基，結(jié)合于轉(zhuǎn)肽酶中心與肽輸出通道狹窄之間的部分，通過機(jī)械性的阻塞通道而抑制新生肽鏈的延伸，從而阻礙蛋白質(zhì)的合成[11]。同時(shí)還可抑制核糖體50S大亞基的組裝，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)有功能的核糖體數(shù)量下降，細(xì)菌蛋白合成能力下降，結(jié)合位點(diǎn)多位于23SrRNAV區(qū)中心環(huán)的A2063、A2064 位[12]。

Morozumi等[13]分析2002～2006年 Mp菌株對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的情況，發(fā)現(xiàn)耐藥株的出現(xiàn)頻率呈增快趨勢。在一定程度上說明Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥非常嚴(yán)重。Pereyre等[4]2007年首次報(bào)道出現(xiàn)了Mp耐藥株，且認(rèn)為Mp對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的主要機(jī)制是23SrRNA發(fā)生點(diǎn)突變。Mp耐藥株的出現(xiàn)造成有效治療抗菌藥物的失效，影響了臨床轉(zhuǎn)歸。目前認(rèn)為Mp耐藥機(jī)制有以下幾種:(1)靶位改變:基因突變或甲基化;(2)主動(dòng)外排;(3)藥物滅活[14]。根據(jù)以往研究結(jié)果[15]，說明某些位點(diǎn)突變與耐藥表型之間有因果關(guān)系，但其突變位點(diǎn)與耐藥表型之間的關(guān)系需要進(jìn)一步證實(shí)。

本研究從400份社區(qū)獲得性呼吸道感染患兒咽拭子標(biāo)本共分離培養(yǎng)出Mp 50株，分離陽性率為12.5%。分離陽性率較其他地區(qū)低[16]，分析原因?yàn)椴杉瘶?biāo)本前部分患兒使用過大環(huán)內(nèi)酯類藥物導(dǎo)致Mp已被抑制。因此不能真正反映Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率。分離培養(yǎng)陽性的50株中有18株耐藥，耐藥率36%。進(jìn)一步說明本地區(qū)患兒中大環(huán)內(nèi)酯類耐藥肺炎支原體比例非常高，需要引起臨床的高度重視。

本研究分離培養(yǎng)并篩選了18株對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的Mp陽性地方株，并研究了其可能的耐藥機(jī)制，結(jié)果證實(shí)23SrRNA V區(qū)靶位基因突變是耐藥性產(chǎn)生的主要機(jī)制。18株耐藥株分別出現(xiàn)A2063G(12/16)、A2064G(3/16)、A2067G(1/16)位點(diǎn)突變，且以A2063G為主(約占75%)。有2株耐藥菌株無基因位點(diǎn)的突變，分析其耐藥可能與Mp耐藥的其他機(jī)制有關(guān)。A2063G突變株表現(xiàn)出對14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯耐藥，A2064G突變株表現(xiàn)為對14、16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯耐藥，A2067G突變株表現(xiàn)出對交沙霉素耐藥。

本研究對所有Mp感染病例給予阿奇霉素治療，32例對大環(huán)內(nèi)酯類敏感未發(fā)生基因突變患者3～7 d發(fā)熱消失，1周左右咳嗽減輕，治療2周后復(fù)查胸片顯示炎性反應(yīng)基本吸收。16例對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥發(fā)生基因突變患者6～10 d發(fā)熱消失，2周左右咳嗽減輕，治療3周后復(fù)查胸片顯示炎性反應(yīng)基本吸收。2例對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥未發(fā)生基因突變患者患者治療后仍有肺紋理增粗，選用左氧氟沙星繼續(xù)治療1周后逐漸恢復(fù)正常。提示耐藥肺炎支原體感染具有難治性，可導(dǎo)致患兒病程延長，給臨床治療帶來困難。

總之，本研究通過對肺炎支原體23SrRNA基因突變位點(diǎn)與耐藥表型的分析，初步了解了本地區(qū)臨床肺炎支原體耐藥現(xiàn)狀及基因突變位點(diǎn)與耐藥表型之間的關(guān)系。但由于研究例數(shù)不多，尚存在局限性，且體外藥敏試驗(yàn)對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的臨床意義尚不十分明確，因此有必要通過復(fù)制動(dòng)物模型來進(jìn)一步研究，為臨床上合理應(yīng)用抗菌藥物提供參考，從而提高臨床對耐藥 Mp的診治水平。

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