李永進(jìn)，歐青葉，劉春曉，史 蕾，趙純中，古莉冰，徐云慶，顧大勇

(1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025;2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 深圳 518045)

結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定對(duì)有效指導(dǎo)臨床用藥、提高療效、控制耐藥結(jié)核病的傳播具有重要意義[1]。目前，雖然有很多方法用于耐藥性測(cè)定，但大都耗時(shí)較長(zhǎng)，如耐藥表型鑒定方法需要4～6周，因此開(kāi)發(fā)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法尤為必要?；蛐酒且环N高通量的分析平臺(tái)，將其應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)已有很多相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]。然而目前的基因芯片技術(shù)主要以熒光檢測(cè)為主，單張芯片的樣本通量低[5-7]。本研究采用微孔板芯片，根據(jù)利福平和異煙肼耐藥與基因突變有關(guān)的分子機(jī)制，制備檢測(cè)突變位點(diǎn)的基因芯片。該芯片檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果在芯片表面直接以色點(diǎn)呈現(xiàn)，結(jié)果既可直接以裸眼觀察，也可配套灰度掃描儀掃描分析。

材料和方法

一、材料

1.測(cè)試菌株及樣本 所有測(cè)試耐藥性菌株均由深圳口岸醫(yī)院提供，耐藥性菌株均經(jīng)過(guò)絕對(duì)濃度法藥物敏感性試驗(yàn)證實(shí)。

2.芯片制作、檢測(cè)設(shè)備及配套試劑 微孔板芯片(N3 CHIP)、探針制備儀、灰度掃描儀均為臺(tái)灣晶宇生物科技實(shí)業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。探針、引物均由Invitrogen(廣州)公司合成。其他試劑均為分析純。

二、方法

1.引物、探針設(shè)計(jì)合成 針對(duì)利福平及異煙肼耐藥相關(guān)的主要基因(rpoB、katG、inhA、ahpC)及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群設(shè)計(jì)5對(duì)引物，引物5'端以生物素標(biāo)記，同時(shí)針對(duì)不同基因的高頻率突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針。本研究中所用的探針及其在芯片的位置、引物分別見(jiàn)表1、表2。

表1 本研究所使用的探針序列及其在芯片上的位置分布

2.DNA制備 耐藥菌株的DNA制備過(guò)程如下:挑取結(jié)核分枝桿菌菌落1～2個(gè)于0.5 mL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-elhylene diamine tetraacetic acid，TE)緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L 乙二胺四乙酸，pH 值 8.0)中重懸，12000×g 4℃離心10 min。沉淀于含有Triton X-100(1%v/v)的30 μL TE緩沖液中重懸，并于95℃孵育30 min。提取物冰上冷卻，12000×g離心10 min。上清液2 μL分裝用于后續(xù)的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增。

表2 本研究所使用的引物序列信息

3.芯片制備 N3微孔板空白芯片采用超聲波法清洗，再用超純水反復(fù)沖洗3次后，吹干備用。利用探針制備儀將合成的探針按預(yù)設(shè)模式點(diǎn)置于芯片盤(pán)內(nèi)，雜交陽(yáng)性探針為15 μmol/L，PCR陽(yáng)性質(zhì)控探針為15 μmol/L，其他探針濃度為20 μmol/L。點(diǎn)好探針的芯片置于紫外交聯(lián)儀中照射3 min，光距為1.5 cm。紫外交聯(lián)后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered，PBS)-0.05%Tween20漂洗3次，再用超純水漂洗3次后晾干，密閉真空包裝，4℃保存待用。

4.PCR擴(kuò)增 合成引物以TE緩沖液稀釋為50 μmol/L貯存液，將不同引物等體積混合。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，具體組成為10×PCR緩沖液(500 mmol/L KCl;100 mmol/L Tris-HCl(pH值9.0);1%Triton X-100;20 mmol/L MgCl2)5 μL，引物混合物溶液(50 pmol/L)10 μL，dNTP(10 mmol/L)混合物4 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，模板DNA 5 μL，補(bǔ)充 ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)在德國(guó)Eppendorf公司 Mastercycler gradient型梯度PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為:95℃ 2 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 2 min;4℃ 10 min。

5.微孔板芯片檢測(cè) 取20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在PCR儀中95℃變性5 min后立即放置冰盒3 min，與180 μL雜交緩沖液(其中加有生物素標(biāo)記的與雜交質(zhì)控探針序列互補(bǔ)的寡核苷酸DNA分子)混勻，加入微孔板芯片微孔內(nèi)，蓋上芯片蓋后置于芯片雜交儀內(nèi)，45℃振動(dòng)雜交反應(yīng)1 h。雜交完成后棄去雜交液，用200 μL洗滌液[2×SSPC-1%十二烷基磺酸鈉]清洗3次，再于微孔內(nèi)加入200 μL 1∶1000稀釋的鏈霉親和素-堿性磷酸酶孵育15 min，再用洗滌液清洗3次，加入稀釋50倍的底物四唑硝基藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸避光顯色5 min，棄去顯色液并用超純水洗2次，置室溫干燥。裸眼觀察雜交結(jié)果或置于芯片掃描儀進(jìn)行圖像掃描。

結(jié) 果

一、芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

為了驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的性能，首先使用野生型結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 野生型結(jié)核分枝桿菌芯片雜交圖

由圖1可見(jiàn)，F(xiàn)5(IS6110)具有很強(qiáng)的信號(hào)響應(yīng)，與我們使用的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌相符。此外，在與耐藥性突變相關(guān)的探針組中，野生型探針位點(diǎn)與PCR產(chǎn)物形成完全互補(bǔ)的復(fù)合物，均有較強(qiáng)的信號(hào)響應(yīng)(A1、A4、B1、B4、B6、C4、C6、E2、E7、F2、F7)，而其他攜帶了突變位點(diǎn)的探針則與PCR產(chǎn)物形成不完全匹配的復(fù)合物，僅有微弱甚至無(wú)信號(hào)響應(yīng)，G2～G7陰性對(duì)照探針點(diǎn)則無(wú)信號(hào)。

二、芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)芯片區(qū)分耐藥突變類型的能力，分別取經(jīng)藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定陽(yáng)性的耐藥性菌株(抗利福平菌株和抗異煙肼菌株)進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖2。F5位點(diǎn)具有很強(qiáng)的信號(hào)響應(yīng)，表明測(cè)定菌株為結(jié)核分枝桿菌菌株。E4位點(diǎn)及F4位點(diǎn)均產(chǎn)生了明顯強(qiáng)于E2及F2位點(diǎn)的信號(hào)響應(yīng)，根據(jù)探針位置分布表明:2種菌株分別為rpoB基因531位點(diǎn)有Ser→Trp的突變，katG 315位點(diǎn)有Ser→Asn的突變，而rpoB及katG基因則分別與利福平及異煙肼的耐藥性緊密相關(guān)，這與應(yīng)用的抗利福平菌株和抗異煙肼菌株結(jié)論一致。

圖2 耐藥性菌株芯片測(cè)試

三、芯片檢測(cè)耐藥性突變類型分析

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)芯片檢測(cè)耐藥性突變類型的性能，對(duì)50株異煙肼耐藥菌株及20株利福平耐藥菌株進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。在50株異煙肼耐藥突變株中，有43個(gè)耐藥突變菌株與katG基因315位的突變有關(guān)，占86%，其中本項(xiàng)目檢出40株(80%)，其他3株為katG其他突變類型，本項(xiàng)目中未涉及相應(yīng)探針，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證主要為328位和335位突變。其他14%的異煙肼耐藥突變發(fā)生在katG基因以外，本項(xiàng)目中未檢出。20株利福平耐藥突變株中，有15株(75%)突變與rpoB基因有關(guān)，其中以531、526位突變居多，分別有7株(占rpoB基因突變的47%)、3株(占rpoB基因突變的20%)，另有25%的利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB基因以外，本項(xiàng)目中未涉及。

圖3 芯片檢測(cè)耐藥菌株基因突變類型分析

討 論

基因突變是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因，而后者又常常導(dǎo)致診斷滯后、不充分治療及更高的致死性。因而，必須采取有效的確診手段以確保所有患者接受有效的診斷，并進(jìn)而接受有效的治療。傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)往往需要增菌培養(yǎng)，使得結(jié)核分枝桿菌耐藥性的鑒定嚴(yán)重滯后?；诖?，快速的結(jié)核分枝桿菌耐藥性的分子鑒定在結(jié)核的臨床治療過(guò)程中顯得尤為重要。在現(xiàn)有的關(guān)于結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)方面，研究最多的是關(guān)于利福平及異煙肼耐藥的研究?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平的耐藥性與rpoB基因上一段81 bp區(qū)域的多態(tài)性有關(guān)，有超過(guò)95%的利福平耐藥性與此區(qū)段的基因突變有關(guān)。異煙肼的耐藥性較利福平而言相對(duì)復(fù)雜，除主要與katG基因有關(guān)外，還與ahpC、inhA等有關(guān)。

現(xiàn)有文獻(xiàn)的調(diào)研表明，應(yīng)用基因芯片進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)及耐藥性突變基因分型鑒定已有相關(guān)報(bào)道，但耐藥性的鑒定主要是進(jìn)行異煙肼的耐藥性鑒定，應(yīng)用芯片技術(shù)同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)并對(duì)耐藥性進(jìn)行鑒定的報(bào)道則相對(duì)少見(jiàn)。此外，現(xiàn)有基因芯片檢測(cè)耐藥性突變的報(bào)道主要以熒光檢測(cè)為手段，同時(shí)單張芯片的檢測(cè)通量有限。

本研究建立的可視化微孔板芯片檢測(cè)方法使用了臺(tái)灣晶宇生物科技實(shí)業(yè)股份有限公司的微孔板芯片，該檢測(cè)方法較其他芯片技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)每個(gè)微孔即為一張芯片，提高了單張芯片的檢測(cè)通量[微孔板芯片常見(jiàn)類型:96孔板芯片，N3 CHIP(三孔板芯片)];(2)檢測(cè)結(jié)果直觀可視(裸眼直接觀察即可)，同時(shí)可配套灰度掃描儀定量分析。此外，該檢測(cè)方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在4 h內(nèi)完成。

為了確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性，本研究首先選擇了IS6110作為鑒定結(jié)核分枝桿菌群的靶標(biāo)，同時(shí)也可作為耐藥性突變的雜交陽(yáng)性質(zhì)控。此外，選擇主要的耐藥性相關(guān)基因rpoB、katG及inhA和ahpC為靶標(biāo)，針對(duì)高發(fā)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針，構(gòu)建了可同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌并對(duì)其耐藥性突變進(jìn)行鑒定的基因芯片。本研究中檢測(cè)的樣本，凡芯片涉及的突變類型，在芯片上均取得了較好的檢測(cè)效果，芯片確定的突變類型經(jīng)與測(cè)序比對(duì)結(jié)論一致，未檢出的耐藥突變經(jīng)測(cè)序表明，其突變類型在本研究中未涉及。

綜上所述，本研究建立了一種新的針對(duì)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性檢測(cè)的可視化微孔板芯片檢測(cè)方法，該方法可快速、準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌并同時(shí)鑒定其耐藥性。該技術(shù)在通關(guān)口岸、疾病控制及衛(wèi)生檢疫部門(mén)檢測(cè)中將具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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