楊立順，袁海生，沈興婭，康建華，王艾云

(天津市中醫(yī)藥大學附屬北辰中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，天津 300400)

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)為高轉換型骨質疏松癥。PMOP是指絕經后婦女由于體內卵巢功能低下、雌激素水平低落、骨偶聯(lián)過程失調、破骨細胞的骨吸收大于成骨細胞的骨形成作用所導致的骨量減少，骨脆性增加，進而易于發(fā)生骨折的代謝性骨疾病。我們通過觀察調控破骨細胞活性的主要因子和骨吸收及骨形成標志物在PMOP患者體內水平的變化，為臨床早期防治骨質疏松提供依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

從2008年2月到2009年4月隨機從居住于天津市并在天津市北辰中醫(yī)醫(yī)院體檢中心體檢的中老年女性中選出符合納入研究標準的88例絕經后女性作為研究對象。研究對象納入標準:漢族，自然絕經年限≥1年，年齡 ＜70歲。其中PMOP患者38例，年齡47～69歲;骨量減低者50例，年齡45～68歲。絕經后骨量正常婦女94名作為正常對照組，年齡45～66歲。曾感染過骨代謝疾病的個體在研究中被排除，包括腎、肝、甲狀旁腺、甲狀腺疾病以及糖尿病、高催乳素血癥、卵巢切除、類風濕關節(jié)炎、惡性腫瘤、血液疾病，以前有病理性骨折和1年內的骨折。另外有下列情況的個體也被排除:3個月內服用過影響骨代謝藥物如糖皮質激素、雌激素、甲狀腺激素、甲狀旁腺激素、氟化物、二磷酸甘油酸、降鈣素、噻嗪類利尿藥、巴比妥酸鹽、免疫抑制劑和維生素D等。

二、骨密度測定

采用美國通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)有限公司生產的Achilles Insight系列超聲骨強度儀對足跟骨進行骨強度測定。骨強度指數(shù)測定結果與診斷骨質疏松的金標準——雙能X線吸收骨密度測定法的相關系數(shù)(r)為0.91，骨強度指數(shù)T-值衰減和骨密度得到的T-值衰減呈線性關系，強度指數(shù)與雙能X射線吸收測定值有同等的精度。根據(jù)“原發(fā)性骨質疏松癥診治指南”:骨強度值低于同性別、同種族健康成人骨峰值的 1s～2.5s(T-值為 －1.0 ～ －2.5)之間的列為骨量低下(骨量減少)組;降低程度≥2.5s(T-值＜－2.5)的列為骨質疏松組。

三、樣本采集和測定

1.樣本采集 受試者均于晨7∶00～9∶00抽取空腹靜脈血，分離血清，樣本保存于－20℃冰箱內。

2.測定指標 血清骨保護素(osteoprotegerin，OPG)與核因子-kβ受體活化因子配體(nuclear factor-k beta receptor activator ligand，RANKL)使用奧地利 Biomedica Medizinprodukte GmbH＆Co.KG公司試劑盒，2個項目批內變異系數(shù)(CV)＜10%，批間CV＜10%;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP)-5b與骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BAP)使用英國Immunodiagnostic Systems公司試劑盒，2個項目的批內CV＜10%，批間CV＜10%，平均回收率分別為100.9%、99.6%。以上4項均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，使用芬蘭產MK3酶標儀及上海思橋測定軟件定量分析。血清同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)采用北京九強生物技術公司生產的循環(huán)酶法檢測試劑盒，CV＜10%;檢測敏感性為1.5 mmol/L。血清雌二醇(estradiol，E2)檢測采用法國梅里埃 miniVIDAS全自動免疫熒光分析儀，使用原裝試劑，批內 CV＜7.5%，批間 CV ＜9.5%，檢測敏感性為 5 pg/mL。各項目檢測的操作按試劑盒說明書進行。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、PMOP組、骨量減低組和正常對照組血清骨代謝指標比較

PMOP組、骨量減低組和正常對照組之間E2、OPG、RANKL、TRACP-5b、BAP、Hcy 水平及 OPG/RANKL比值差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05、P＜0.01、P ＜0.001)。PMOP 組 BAP 水平明顯高于骨量減低組及正常對照組(P＜0.001)，E2水平明顯低于骨量減低組(P＜0.001)及正常對照組(P＜0.05)。骨量減低組與正常對照組之間BAP和E2水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 3組骨代謝指標比較()

表1 3組骨代謝指標比較()

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01、＊＊＊P ＜0.001;與 PMOP 組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01、###P ＜0.001

組別 例數(shù) 年齡(歲) TRACP-5b(U/L) BAP(μg/L) Hcy(mmol/L)正常對照組 94 54.19 ±4.91 3.02 ±0.66 12.69 ±4.04 18.03 ±6.92骨量減低組 50 53.22 ±5.90## 3.39 ±0.77＊＊# 13.45 ±5.02### 20.80 ±7.11*#PMOP 組 38 56.85 ±6.21＊＊ 3.64 ±0.78＊＊＊ 17.28 ±6.19＊＊＊ 24.58 ±11.18＊＊＊OPG/RANKL正常對照組組別 例數(shù) E2(pg/mL) OPG(pmol/L) RANKL(pmol/L)94 22.57 ±9.93 3.10 ±0.44 0.33 ±0.07 9.99 ±3.22骨量減低組 50 19.60 ±7.76# 2.75 ±0.36＊＊＊# 0.36 ±0.06*### 7.96 ±2.16＊＊＊#PMOP 組 38 14.41 ±12.66＊＊＊ 2.56 ±0.57＊＊＊ 0.42 ±0.08＊＊＊ 6.51 ±2.02＊＊＊

二、各項指標的偏相關分析

1.控制年齡因素后，E2與 TRACP-5b、BAP呈負相關[r值分別為 －0.198(P=0.007)，－0.157(P=0.035)]，與 OPG、RANKL 和 Hcy無相關性[r值分別為 0.106(P=0.154)、－0.132(P=0.076)、0.030(P=0.69)]。

2.控制年齡、E2 因素后，Hcy與 RANKL、TRACP-5b、BAP 呈正相關[r值分別為 0.368(P ＜0.001)、0.193(P=0.009)、0.224(P=0.002)]，與 OPG 呈負相關(r= －0.330，P ＜0.001)。

3.OPG 與 TRACP-5b呈負相關(r= －0.458，P=0.008)，RANKL 與 BAP 呈正相關(r=0.228、P=0.044)。

三、ROC曲線分析

采用 ROC 曲線評價 E2、Hcy、OPG、RANKL、TRACP-5b、BAP對PMOP的診斷準確度，見表2、圖1、圖2。TRACP-5b和BAP診斷骨質疏松的Cut-off值分別是3.44 U/L 和 17.84 μg/L。

表2 各項目對PMOP的診斷準確度

圖1 TRACP、BAP、Hcy、RANKL 檢測 ROC 曲線

圖2 E2、OPG檢測ROC曲線

四、PMOP影響因素的Logistic回歸分析

二分類Logistic回歸分析表明，獨立于年齡，血清 E2、TRACP-5b、OPG、Hcy對骨質疏松有顯著影響，OPG、E2為保護因素，Hcy、TRACP-5b為危險因素。見表3。

表3 骨質疏松影響因素的Logistic回歸分析

討 論

大量事實證明[1-3]，雌激素對骨形成有促進作用，那么當雌激素缺乏時，就應當出現(xiàn)骨形成障礙，然而大量臨床試驗證實，絕經后女性雌激素水平降低時，骨吸收亢進的同時，骨形成也亢進，發(fā)生高轉換型骨質疏松癥。近年來，發(fā)現(xiàn) OPG/RANKL/核因子-kβ受體活化因子(nuclear factork beta receptor activator，RANK)系統(tǒng)可調控破骨細胞的生成及其功能，達到抗骨質疏松或致骨質疏松的作用。

OPG是一種分泌型糖蛋白和缺乏跨膜結構域的TNF受體家族成員。OPG的配基RANKL在骨骼中的主要作用為刺激破骨細胞的分化和活性，抑制破骨細胞的凋亡，是成熟破骨細胞形成的主要刺激因子，而且對其生存很重要，其表達的增加會導致骨吸收和骨丟失。目前大量研究表明OPG與RANKL在破骨細胞發(fā)育的終末階段發(fā)揮重要作用，是破骨細胞分化和維持功能的最終調節(jié)因子[4]。RANK是破骨細胞表面介導 RANKL生物活性的的唯一受體，而OPG是RANKL的競爭配體，通過競爭性抑制RANKL與RANK的結合，而達到抑制破骨細胞分化成熟的作用，從而抑制骨吸收。本研究中病例組的血清OPG水平顯著低于正常對照組，表明在絕經后婦女中，OPG的減低降低了競爭性抑制RANKL與RANK的結合，增強了破骨細胞分化成熟，骨吸收增強，影響了機體OPG/RANKL系統(tǒng)的偶聯(lián)平衡，進而破壞了骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡，導致骨質疏松癥患者骨吸收大于骨形成，最終導致骨破壞和骨丟失。通過Logistic回歸分析得出，血清OPG對骨質疏松有顯著影響，提示血清OPG的增高可能是延緩骨吸收和骨丟失的保護機制[5]，對維持絕經后的骨量起到重要作用，是骨折的保護因素。這個結果與 Rogers等[6]、Mezquita-Raya 等[7]和梁少俊等[4]的研究相仿。而RANKL則相反，兩病例組均高于正常對照組，證實了RANKL在骨質疏松中刺激破骨細胞分化、抑制破骨細胞凋亡、增加骨吸收和骨丟失的作用。

雌激素是一種調節(jié)OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的上游因子。有體外試驗表明E2能提高OPG mRNA的水平及表達，明顯提高OPG的水平[8];還能有效地降低體內IL-1、IL-6等細胞因子的水平，間接抑制成骨細胞分泌RANKL[9]。然而在本研究中雖發(fā)現(xiàn)E2下降的同時伴有OPG降低、RANKL升高，但并沒發(fā)現(xiàn) OPG、RANKL與血清E2有相關關系。這可能與本研究的病例選取、例數(shù)有限有關。

最近的流行病學調查顯示，Hcy水平增高可能成為骨質疏松獨立的危險因素之一[10-13]，其機制主要是通過增加骨吸收，抑制骨形成及膠原蛋白的交聯(lián)而減少骨密度，降低骨質量，增加骨質疏松的危險性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組Hcy水平明顯高于正常對照組，并且與血清OPG、RANKL具有相關性，進一步證實了Hcy是通過RANKL誘導細胞分化成破骨細胞，以及抑制破骨細胞的程序性凋亡直接增加破骨細胞的形成，抑制成骨細胞的活性，減少膠原蛋白交聯(lián)而導致骨質疏松的。通過Logistic回歸分析，高Hcy是患PMOP的一個獨立的危險因素，深入研究Hcy的致病機制，通過干預其影響因素而降低骨質疏松癥在絕經后婦女、老年人中的發(fā)生率將有重要意義。

骨質疏松的早期診斷一直是人們研究的熱點。本研究選擇了骨吸收標志物TRACP-5b與骨形成標志物BAP進行研究。TRACP主要來源于骨吸收過程中破骨細胞的釋放，來源于破骨細胞的TRACP-5b具有酶活性[15]。女性絕經期后，血清TRACP-5b水平有所升高，如果患有骨質疏松，其水平增加更明顯。本研究看到，病例組血清TRACP-5b水平顯著高于正常對照組，診斷骨質疏松的ROC曲線下面積為0.731，通過二分類Logistic分析，對骨質疏松的影響顯著。因此，骨吸收生化標志物TRACP-5b可以作為鑒別快速骨量丟失、診斷骨質疏松的可靠指標，同時也是一項較好的抗骨吸收治療的監(jiān)測指標。本研究得出TRACP-5b診斷骨質疏松的Cut-off值為3.44 U/L。

BAP是成骨細胞的胞外酶，由于其來源于成骨細胞，排除肝、腎、腸等疾病影響，故成為反映成骨細胞活性和骨形成的特異及敏感指標，成骨細胞活性增強，則BAP分泌增加[16]。本研究結果表明，PMOP組BAP水平明顯高于無骨質疏松的其他兩組。證實了PMOP為一種高轉換型的骨代謝病，骨吸收與骨形成同時增強。BAP的檢測對骨代謝疾病骨轉換類型的判斷有很好的價值。本研究得出 BAP診斷骨質疏松的 Cut-off值為17.84 μg/L。

綜上所述，血清 E2、OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是骨質疏松發(fā)病機制的重要因素;血清 E2、OPG、Hcy與TRACP-5b是對骨質疏松有明顯影響的獨立因素，可以作為更加準確的單獨預測骨質疏松的生化標志物。

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