趙雪濤，高 昆，張春華

(上海市徐匯區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗科，上海 200237)

致瀉性大腸埃希菌(diagrrheagenic Escherichia coli，DEC)包括致病性大腸埃希菌(entreopathogenic Escherichia coli，EPEC)、產(chǎn)毒性大腸埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)、侵襲性大腸埃希菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)、腸出血性大腸埃希菌(enterohoemorrhagic Escherichia coli，EHEC)和聚集性大腸埃希菌(entroaggregative Escherichia coli，EAEC)，是重要的引起腹瀉的病原性細(xì)菌。近年來國內(nèi)外的報道還有彌散性聚集大腸埃希菌(dissfuely adheret Escherichia coli，DAEC)、產(chǎn)非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)毒素大腸埃希菌[1]。因其致病基因多種多樣，病理過程各異，且目前我國大多數(shù)的臨床微生物實驗室針對腸道病原菌的分子檢測較不普及，依然沿用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，故檢出率較低，對于病原菌本身了解不多，對于DEC的流行病學(xué)特征了解較為缺乏。本次研究監(jiān)測2011年6月至2012年5月的徐匯區(qū)某醫(yī)院腸道門診病例，按照上海市腸道傳染病監(jiān)測方案的要求規(guī)范采樣，進(jìn)行DEC的持續(xù)監(jiān)測，以求了解和掌握本區(qū)域內(nèi)DEC的病原學(xué)特點(diǎn)和流行病學(xué)特征。

材料和方法

一、標(biāo)本與病例選擇

來自于2011年6月至2012年5月的徐匯區(qū)某醫(yī)院腸道門診病例，按照上海市腸道傳染病監(jiān)測方案的要求規(guī)范采樣，采樣于運(yùn)送培養(yǎng)基(carrierblair培養(yǎng)基)，24 h內(nèi)送至實驗室初次分離接種。

二、方法

1.細(xì)菌接種分離培養(yǎng) 標(biāo)本直接于SS培養(yǎng)基劃線分離，37℃培養(yǎng)20 h后挑取形態(tài)為粉紅色、發(fā)酵乳糖的單個菌落，純分離接種營養(yǎng)瓊脂斜面和LB肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8 h后備用。營養(yǎng)瓊脂的純分離用于進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。

2.革蘭染色 使用珠海貝索的革蘭染液。

3.大腸埃希菌屬的生化鑒定 使用VITEK COMPACT全自動細(xì)菌鑒定儀和革蘭陰性菌鑒定卡(GN)鑒定。

4.細(xì)菌核酸提取 使用煮沸法。挑取單個欲測試菌落，在含 0.1%Triton X-100、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acide，EDTA)的100 μL配制溶液的離心管中懸浮，放入100℃金屬浴中5 min，然后用微量離心機(jī)于室溫以12000×g離心5 min，取上清即可用于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測。

5.PCR反應(yīng)體系 鎂離子濃度為5 mmol/L，上下游引物濃度各為250 nmol/L，探針濃度為150 nmol/L，DNTP 濃度為 0.2 mmol/L，Taq 酶為2 IU，模板 3 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足總體積為 30 μL。

6.PCR反應(yīng)條件 37℃ 2 min，94℃ 3 min;94℃ 10 s，60℃ 40 s，40個循環(huán);在60℃時檢測熒光值。

7.DEC各毒力基因引物和探針序列 以premier公司的beacon designer 7.90版本的軟件直接獲取基因編號序列，用軟件選取上下游引物和taqman探針。見表1。

表1 DEC各毒力基因引物和探針序列

8.儀器與試劑 Biorad IQ5熒光定量PCR儀，PCR用引物、探針及 DNTP等試劑均由上海賽百盛生物技術(shù)有限公司合成，選用的培養(yǎng)基均來源于上海市疾病預(yù)防控制中心培養(yǎng)基室，且所有試劑耗材均在有效期內(nèi)使用。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用Stata 7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行 χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、整體陽性率和各類DEC的陽性率

2011年6月至2012年5月共檢測標(biāo)本834例，其中 EPEC(Eae+和/或 Bfpa+)21株，ETEC(ST+和/或 LT+)55 株，EHEC(Eae+且 VT1+和/或 VT2+)2株，EAEC(AggR+)19株，DAEC(DraaC+)42株，eastA+檢出51株，EIEC(Ial+)未檢出。見表2、圖1。

表2 2011年6月至2012年5月DEC監(jiān)測整體情況

圖1 DEC監(jiān)測月度陽性分布圖

二、年齡分布

ETEC、EPEC和EHEC各年齡組陽性例數(shù)無明顯差異，EAEC多見于小年齡組，DAEC多見于老年齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

三、性別分布

在 ETEC、EPEC+EHEC、EAEC、DAEC、eastA+各類檢出陽性病例中，男女性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

四、ETEC的陽性月度分布特征

ETEC共檢出55株，在各類DEC中檢出率居首，在年度的5月至11月均有檢出，此后各月均未檢出。ETEC明顯高發(fā)于夏季，有明顯的季節(jié)性特征。見圖2。

表3 DEC檢出病例的年齡組分布特征

表4 DEC檢出病例的性別差異分布

圖2 ETEC(ST+和/或LT+)陽性檢出分布圖

五、EPEC和EHEC的陽性檢出情況與月度分布

EHEC在監(jiān)測期間共檢出2例，呈散發(fā)狀態(tài)，EPEC多見于春末夏初(5、6、7月份)、夏末及秋季(10、11、12、1 月)。見圖3。

圖3 EPEC和EHEC(Eae+和/或VT1+/VT2+)陽性檢出分布圖

六、EAEC、DAEC及ETEC的陽性檢出月度分布

EAEC共檢出19株，DAEC共檢出42株，ETEC共檢出55株。EAEC呈波動特征，全年幾乎都有發(fā)生，季節(jié)性不明顯;DAEA和ETEC具有季節(jié)性背行分布特征。見圖4。

七、EPEC與EHEC血清型的關(guān)聯(lián)性

EPEC 檢出 O55、O26、O111、O128、O157 等多個血清型，而檢出的2例EHEC分別為O111和O157。同一血清型別但攜帶毒力基因的不同是分類差異的原因，這提示某些血清型型別的EPEC可能更容易受噬菌體感染而導(dǎo)致基因整合后攜帶Vero細(xì)胞毒素基因片段。

圖4 EAEC、ETEC和DAEC的陽性檢出月度分布圖

八、eastA+株

在所有的ST+株中都攜帶有eastA，在EPEC中同時有 eastA+為28.57%(6/21)，EAEC 中同時有eastA+為63.84%(7/19)，DAEC 中同時有 eastA+為38.09%(16/42)。除此之外，僅eastA毒力基因片段陽性檢出為6.12%(51/834)，僅次于ETEC。

討 論

DEC屬于最常見的大腸埃希菌的一類，也是引起腹瀉的常見病原菌之一。國內(nèi)對于DEC的檢測報道多為突發(fā)事件的個案報告[4-6]，作為最易培養(yǎng)和最常見的腸道病原菌之一，卻因為形態(tài)難以簡單識別、分類方法定義不明確、新方法開展不普及而造成國內(nèi)大多數(shù)實驗室對于DEC的檢測與監(jiān)測一直未能有效持續(xù)的開展，在此基礎(chǔ)上對其流行病學(xué)規(guī)律與特征的研究更無從談起。

本研究選取了包含最常見分類的各個毒力基因片段設(shè)計的探針和引物序列，新增DAEC與eastA的2個比較新的毒力基因片段，對上海市徐匯區(qū)的臨床腸道門診腹瀉病例進(jìn)行了1年多的連續(xù)性監(jiān)測，按照不同的統(tǒng)計分類，DEC年度整體的感染率為腸道門診腹瀉病例的9%(EIEC+EPEC+ETEC+EHEC)、12%(含 EAEC)、17%(含EAEC 和DAEC)、23%(含eastA+)，有季節(jié)性的變化，夏秋季節(jié)較高，冬春季節(jié)稍低。在各類別DEC中，ETEC的高峰在夏季的7～9月份;EPEC雖然整體占比不高，但1年中的5～11月份占有一定的比例，若帶有VT毒素基因的EHEC致病性更強(qiáng)，造成的癥狀更嚴(yán)重。

此次監(jiān)測結(jié)果提示我們DEC具有以下幾方面的特征:(1)全年陽性率波動(單月陽性率3:14%～23%)的狀況下，陽性檢出率結(jié)構(gòu)性的特征明顯，如ETEC與DAEC的發(fā)病時間交替與錯峰，在單一型別高發(fā)期間(如8～9月份的ETEC和1～2月份DAEC)，其他型別則幾乎不檢出;(2)本區(qū)域內(nèi)的DAEC加EAEC的感染發(fā)病率甚至要超過季節(jié)性高峰的ETEC全年發(fā)病率，EAEC和 DAEC致病過程為聚集黏附，尤其是DAEC幾乎沒有主動黏附機(jī)制，致病性不強(qiáng)，多數(shù)是癥狀較輕的病例，EAEC整年都有一定比例，但人群分布特征明顯，主要是少兒(＜6歲)和老人(＞65歲)，尤其是少兒的比例更高;DAEC高發(fā)期為冬季的12～2月份，人群特征主要為老人;(3)在此次的監(jiān)測中存在大量的單基因eastA+株，eastA原為EAEC的一個非特異性的毒力基因，一般認(rèn)為其與EAEC和DAEC關(guān)系密切，eastA單陽性株的存在究竟是EAEC和DAEC的變異還是普通大腸埃希菌接受了EAEC和DAEC的質(zhì)粒而獲得部分毒力，這值得進(jìn)一步深入研究。

DEC較常見，其形態(tài)與普通大腸埃希菌無異，傳統(tǒng)檢測僅僅依靠培養(yǎng)加血清凝集的方法，繁瑣且低效。隨著國外近年來在DEC的分類與鑒別中的進(jìn)展，血清學(xué)定型與分型很難再作為確定分類的依據(jù)，在某一個血清型別之下，因為攜帶的毒力基因的不同也可能被分為不同的EPEC或EHEC，而且由于很多的毒力基因都由大腸埃希菌的質(zhì)粒攜帶[7]，質(zhì)粒的傳遞會造成原本某一血清型別的大腸埃希菌變?yōu)榉中鸵饬x上的另一類。DEC的致病性以及分類的模糊與其質(zhì)粒攜帶的毒力基因的轉(zhuǎn)移和溶原性噬菌體的序列整合有關(guān)，如2011年在德國爆發(fā)的引起大面積感染的病原O104的血清型[8]，其攜帶 AggR+質(zhì)粒，而且 Eae、VT1 和/或 VT2毒力基因陽性，因其引起的癥狀為溶血性尿毒綜合征，而被分類為EHEC，但其攜帶的AggR+質(zhì)粒，是EAEC的特異性毒力基因，故而也有將O104稱為EHAEC[9]。

近年來國外對于DEC致病性、分類乃至體內(nèi)、體外的生物學(xué)特征和分子生物學(xué)致病機(jī)制的研究已取得了長足的進(jìn)步，國內(nèi)由于沒有廣泛的、完整的、持續(xù)的監(jiān)測實踐作為基礎(chǔ)，無論是實驗室還是流行病學(xué)人員對DEC的流行病學(xué)特征、檢測手段、分類分型特征、遺傳變異等各方面的了解都亟待提高。

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