黃曉春， 陳 巖， 李 園， 許 育， 秦陽華

(第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院實驗診斷科，上海 200433)

隨著抗菌藥物以及免疫抑制劑的廣泛使用，鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)特別是多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動桿菌引起的感染在臨床上越來越常見。快速、準確的鑒定和藥物敏感性試驗是患者治療、醫(yī)院感染控制的前提和關鍵。目前臨床上通常采用全自動細菌鑒定和藥物敏感性檢測儀進行細菌鑒定和藥物敏感性試驗，如法國生物梅里埃公司VITEK?2 COMPACT全自動細菌鑒定儀(簡稱VITEK 2C)結合其微生物鑒定藥物敏感性智能專家系統(tǒng)，能在較短時間內(6 h)完成檢測，極大地縮短了臨床微生物檢測周期。但較短的孵育時間也帶來了一些檢測結果不確定的風險，有文獻報道檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星的敏感性，當檢測出最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為 8 或16 μg/mL時需要采用其他替代方法如紙片藥物敏感性試驗進行測試[1-2]。我們在臨床工作中發(fā)現部分鮑曼不動桿菌對阿米卡星采用AST-GN13卡在VITEK 2C上檢測結果為4或≤2 μg/mL，而臨床應用阿米卡星治療效果不佳，采用紙片藥物敏感性試驗檢測時發(fā)現呈現雙圈抑制，往往為高度耐藥(抑菌圈直徑6 mm)。為了評價VITEK 2C檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星MIC的準確性，我們做了系統(tǒng)研究。

材料和方法

一、菌種來源

2012年第3季度長海醫(yī)院臨床分離38株鮑曼不動桿菌，均經革蘭染色顯微鏡下形態(tài)觀察為革蘭陰性球桿菌，克氏雙糖管不分解乳糖和葡萄糖，41和44℃生長，VITEK 2C GN卡鑒定為鮑曼復合群。

二、方法

1.藥物敏感性試驗 采取3種方法檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星的敏感性:(1)采用ASTGN13卡(法國生物梅里埃公司)在VITEK 2C上測定，操作根據儀器操作規(guī)程進行，AST-GN13卡上阿米卡星共有 3個濃度，分別為 8、16和64 μg/mL，報告濃度范圍為≤2 ～ ≥64 μg/mL;(2)采用Kirby-Bauer紙片擴散(KB)法，藥物敏感性紙片含阿米卡星30 μg(英國OXOID公司)，采用標準菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)和銅綠假單胞菌(ATCC 27853)對KB法進行質量控制。藥物敏感性試驗步驟按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)文件(M02-A11、M100-S22)標準進行;(3)采用微量肉湯稀釋(broth microdilution，BMD)法測定阿米卡星體外抑制鮑曼不動桿菌的MIC。采用陽離子調整的Mueller-Hinton肉湯(英國OXOID公司)根據CLSI M07-A9文件進行檢測，阿米卡星藥物濃度范圍為0.5～512 μg/mL共11個濃度梯度。

體外藥物敏感性試驗結果根據CLSI M100-S22[3]進行判斷，MIC≤16 μg/mL 敏感，MIC≥64 μg/mL耐藥，MIC=32 μg/mL 為中敏，KB 法直徑≥17 mm敏感，直徑≤14 mm耐藥，介于兩者之間為中介。

2.氨基糖苷修飾酶基因檢測 (1)模板DNA的提取:用1 μL接種環(huán)挑取一環(huán)麥康凱平板上生長的單個菌落，混懸于含有滅菌蒸溜水250 μL的 Eppedorf管中，100 ℃ 加熱 15 min，以12000×g離心10 min，上清即模板DNA，分裝后－20℃保存;(2)PCR擴增:氨基糖苷修飾酶基因引物序列根據文獻[1，4]合成，具體序列見表1。8對引物分3管進行多重PCR擴增，試劑采用大連TaKaRa公司預混PCR反應液。多重PCR1擴增氨基糖苷乙酰轉移酶(aminoglycoside acetyltransferases，AAC)基因 aac(3)-Ⅰa，aac(3)-Ⅱa，aac(6')-Ⅰh);多重PCR 2擴增氨基糖苷磷酸轉移酶(aminoglycoside phosphotransferase，APH)基因 aph(3')-Ⅵ)、氨基糖苷腺苷轉移酶(aminoglycoside adenyltransferase，ANT)基因 ant(2'')-Ⅰa 和內部質控 16S RNA片段(rrn);多重PCR3擴增APH基因aph(3')-Ⅰa和AAC基因aac(6')-Ⅰb。反應條件為95℃預變性5 min;95℃變性30 s，49℃(多重 PCR 1和2)，55 ℃(多重PCR 3)退火60 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed(美國Biotium公司)染色后，紫外線照射觀察結果并拍照。

表1 氨基糖苷修飾酶基因PCR引物序列

三、統(tǒng)計學方法

不同藥物敏感性試驗之間以及鮑曼不動桿菌基因型和表型之間的比較采用GraphPad Prism 5軟件進行 χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、臨床資料調查

38株鮑曼不動桿菌臨床分離株來自全院各科室，風濕科、普外科、神經內科、消化科和血液內科各1株，其余33株均來源于重癥監(jiān)護室(燒傷科監(jiān)護室9株、胸外科監(jiān)護室15株、腦外科監(jiān)護室3株、急救科監(jiān)護室6株)，分布較為集中，患者大多接受過氣管插管或切開及機械通氣治療。其中27株分離于痰液標本，4株分離于血液標本，5株分離于傷口分泌物標本，2株分離于清潔中段尿標本。

二、體外藥物敏感性試驗

3種體外藥物敏感性試驗檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星的敏感性結果見表2。BMD法、KB法和VITEK 2C檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星的耐藥率分別為71.1%、76.3%和18.4%。經統(tǒng)計分析BMD法和KB法檢測結果之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.57)，BMD法和VITEK 2C檢測結果之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。以BMD法為參比方法，KB法結果比較理想，一致率達到94.7%，1株結果出現重大誤差(BMD法為敏感，MIC=4 μg/mL，而KB法因為抑菌圈內有小的菌落而判斷為耐藥)，1株結果出現次要誤差(BMD法為中介，MIC=32 μg/mL，而KB法抑菌圈內有小的菌落而判斷為耐藥);而VITEK 2C結果則誤差較大，一致率只有44.7%，19株結果出現重大誤差(BMD法為高度耐藥，而VITEK 2C結果為敏感，MIC 值為≤2、4 或8 μg/mL)，2株結果出現次要誤差(1株BMD法為耐藥，而VITEK 2C結果為中介;另一株BMD法為中介而VITEK 2C結果為敏感)。

三、氨基糖苷修飾酶檢測

38株鮑曼不動桿菌氨基糖苷修飾酶檢測結果見圖1，具體基因型見表3。引起鮑曼不動桿菌對阿米卡星耐藥的主要基因型為aac(3)-Ⅱa+aac(6')-Ⅰb+aph(3')-Ⅰa，表現為對阿米卡星高濃度耐藥(MIC≥512 μg/mL)，對阿米卡星敏感的11株鮑曼不動桿菌中有4株檢測出不同氨基糖苷修飾酶基因。

四、VITEK 2C檢測出現誤差的鮑曼不動桿菌氨基糖苷修飾酶基因型

以BMD法為參照，VITEK 2C檢測阿米卡星MIC出現誤差的鮑曼不動桿菌氨基糖苷修飾酶基因型分布見表4。最多的基因型為aac(3)-Ⅱa+aac(6')-Ⅰb+aph(3')-Ⅰa，共有 11 株(7 株 MIC 值為 4 μg/mL，4 株 MIC 值為8 μg/mL)。

表2 3種藥物敏感性試驗檢測38株鮑曼不動桿菌的結果比較

圖1 鮑曼不動桿菌氨基糖苷修飾酶基因檢測

表3 38株鮑曼不動桿菌氨基糖苷酶基因分型

表4 VITEK 2C和BMD法檢測結果不符的21株鮑曼不動桿菌基因型

討 論

氨基糖苷類抗菌藥物臨床應用迄今已有50多年，因其具有濃度依賴性快速殺菌作用，與β-內酰胺類抗菌藥物聯(lián)合使用可提高抗菌作用，廣泛用于革蘭陰性桿菌所致的敗血癥、感染性心內膜炎和其他嚴重感染。隨著抗菌藥物以及免疫抑制劑的廣泛使用，鮑曼不動桿菌引起的感染在臨床上越來越常見。醫(yī)院感染病原菌中鮑曼不動桿菌分離率一直處于前列，是引起醫(yī)院感染的主要病原菌之一。隨著多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動桿菌的出現和在臨床蔓延，其診斷和治療也越來越受到醫(yī)生、感染控制專家和檢驗人員的重視。本研究顯示，VITEK 2C在檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星的敏感性時出現了誤差，主要表現為MIC結果為敏感范圍內而采用其他方法(KB法、BMD法)結果則為耐藥，PCR檢測氨基糖苷類耐藥基因也提示含有耐藥基因，說明采用VITEK 2C檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星的敏感性存在不準確性，需要用其他方法進行檢測。

我們首先分別采用3種方法檢測38株臨床分離的鮑曼不動桿菌對阿米卡星的敏感性，結果顯示KB法和BMD法之間有很好的一致性，而VITEK 2C檢測結果與BMD法之間存在差異，主要表現為VITEK 2C自動檢測MIC值4或≤2 μg/mL，而BMD法檢測卻顯示為高度耐藥(≥512 μg/mL)。

鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥主要是產生氨基糖苷修飾酶，包括APH、AAC、ANT。被修飾后的藥物與核糖體氨酰-tRNA的親和力大大減弱，失去了干擾細菌蛋白質合成的能力，使細菌對氨基糖苷類藥物產生抗性。我們采用PCR檢測氨基糖苷類耐藥基因，證明出現誤差的21株菌株均檢測出耐藥基因，大多數含有2個以上的耐藥基因，最常見的基因型為aac(3)-Ⅱa+aac(6')-Ⅰb+aph(3')-Ⅰa。

造成VITEK 2C檢測出現誤差的原因可能是因為在鮑曼不動桿菌中對阿米卡星存在誘導性耐藥。采用KB法檢測時發(fā)現阿米卡星紙片周圍出現了雙圈耐藥現象，即抑菌圈與紙片之間出現了一個生長圈。國內外不少文獻對雙圈耐藥現象進行了研究，發(fā)現主要由于鮑曼不動桿菌通過Ⅰ類整合子獲得AAC耐藥基因，并且該耐藥基因可以被阿米卡星誘導而表達增加[5-9]。經過連續(xù)傳代雙圈耐藥現象會消失，說明誘導表達的耐藥基因可以轉變?yōu)榻M成性表達。由于VITEK 2C檢測周期短，鮑曼不動桿菌藥物敏感性試驗檢測時間為6～8 h，并且可誘導耐藥基因表達依賴特定濃度范圍的阿米卡星，從而造成了檢測值偏低。

本研究針對VITEK 2C檢測鮑曼不動桿菌對阿米卡星敏感性出現誤差的現象，檢測了鮑曼不動桿菌中氨基糖苷類耐藥基因的存在情況，并探討了出現誤差的可能原因，提示目前鮑曼不動桿菌藥物敏感性試驗結果為多重耐藥而對阿米卡星的耐藥性檢測顯示為敏感的可以改用KB法結果替代。

[1]Akers KS，Chaney C，Barsoumian A，et al.Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex[J].J Clin Microbiol，2010，48(4):1132-1138.

[2]Jung S，Yu JK，Shin SH，et al.False susceptibility to amikacin by VITEK 2 in Acinetobacter baumannii harboring armA [J].Ann Clin Lab Sci，2010，40(2):167-171.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].M100-S22，CLSI，2012.

[4]Noppe-Leclercq I，Wallet F，Haentjens S，et al.PCR detection of aminoglycoside resistance genes:a rapid molecular typing method for Acinetobacter baumannii[J].Res Microbiol，1999，150(5):317-322.

[5]Gu B，Tong M，Zhao W，et al.Prevalence and characterization of classⅠintegrons among Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii isolates from patients in Nanjing，China [J].J Clin Microbiol，2007，45(1):241-243.

[6]鄧進進，邵海楓，王衛(wèi)萍，等.鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物雙圈耐藥現象的初步探討[J].臨床檢驗雜志，2008，26(2):90-92.

[7]汪鵬程，蔡 俊，閆 敏，等.鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥及其攜帶基因的探討[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33(10):1155-1156.

[8]張曉文，邵海楓，王衛(wèi)萍，等.導致氨基糖苷類藥物雙圈耐藥型鮑曼不動桿菌的相關攜帶基因研究[J].臨床檢驗雜志，2011，29(1):19-21.

[9]張曉文，邵海楓，王衛(wèi)萍，等.氨基糖苷類藥物雙圈耐藥型鮑曼不動桿菌16S rRNA甲基化酶基因研究[J].中國抗生素雜志，2011，36(11):855-858.