何 軒，彭光勇，黃露露，王云召，劉 錦，彭湘萍，李春艷

（吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首 416000）

黃瓜香水提物對自由基損傷心肌細(xì)胞的作用＊

何 軒，彭光勇，黃露露，王云召，劉 錦，彭湘萍，李春艷

（吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首 416000）

目的 觀察黃瓜香水提物對自由基損傷的心肌細(xì)胞的作用.方法 體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，以不同濃度的黃瓜香水提物進(jìn)行干預(yù)，測定心肌細(xì)胞搏動頻率及培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）的活性，采用MTT法觀察黃瓜香水提物對心肌細(xì)胞存活率的影響.結(jié)果自由基對心肌細(xì)胞造成損傷，不同濃度的黃瓜香水提物可減少LDH漏出，增加細(xì)胞存活率（P＜0.05）.結(jié)論 黃瓜香對自由基損傷的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用.

黃瓜香水提物；心肌細(xì)胞；自由基

湘西民間草藥黃瓜香主要的化學(xué)成分是黃酮，黃酮對擴(kuò)張冠狀動脈、增加血管灌流量和心肌營養(yǎng)性血流、增加心肌收縮力、抗心律失常和調(diào)脂降壓等均有明顯的效應(yīng)［1］.研究開發(fā)安全有效的天然藥物已成為醫(yī)藥界的探索熱點，文獻(xiàn)［2］研究已顯示黃瓜香水提物具有保護(hù)大鼠急性心肌缺血作用.本文采用心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，觀察黃瓜香水提物對自由基損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，為黃瓜香的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

新生SD大鼠（雌雄不拒），由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供，新生牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶、DMEM（Gibco公司），乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（南京建成生物有限公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純.723分光光度計（上海光譜儀器有限公司），酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），倒置顯微鏡（日本Nikon），低溫高速離心機(jī)（上海儀器儀表有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（IT61，日本），超凈工作臺（中國蘇州設(shè)備公司）.

1.2 黃瓜香水提物

黃瓜香的全草水提取物由吉首大學(xué)藥理學(xué)實驗室提供，采用傳統(tǒng)方法水提、濃縮，臨用時稀釋成所需（實驗室所用劑量均與生藥計）3種質(zhì)量濃度（2g／mL，1g／mL，0.5g／mL），過濾除菌備用.

1.3 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

取24h內(nèi)新生乳鼠，在無菌狀態(tài)下取出心臟組織剪碎，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%胰酶反復(fù)消化.將收集的細(xì)胞制備成心肌細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)皿，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%DMEM培養(yǎng)液置于37℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% CO2孵箱進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)每48h換1次培養(yǎng)液.

1.4 實驗分組

實驗分為3組.正常對照組：加入等體積生理鹽水.損傷組：加入黃嘌呤100μL和黃嘌呤氧化酶1 50μL，調(diào)整培養(yǎng)液中最終濃度為5.0mol／L和5×10－5mol／L［3］.藥物處理組：每孔加入250μL不同濃度黃瓜香水提物后，按損傷組依次加入黃嘌呤100μL和黃嘌呤氧化酶150μL.

1.5 觀察指標(biāo)及方法

各實驗組用倒置顯微鏡觀察并計數(shù)心肌細(xì)胞搏動的頻率.取培養(yǎng)上清液按照試劑盒說明測定LDH活性.MTT比色法測定細(xì)胞存活率，每孔加5mg／mL MTT 20μL，再培養(yǎng)4h后，加DMSO 150μL／孔，室溫振蕩10min，待試劑完全溶解后，用酶標(biāo)儀在波長490nm處讀取吸光度（OD）.取6孔OD值的均數(shù)按公式計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率＝處理組細(xì)胞OD均值／對照組細(xì)胞OD均值×100%.

2 結(jié)果

2.1 黃瓜香水提物對心肌細(xì)胞搏動的影響

正常組心肌細(xì)胞搏動正常，節(jié)律規(guī)則，搏動有力.損傷組心肌細(xì)胞搏動頻率減慢，搏動幅度減弱，有部分脫落.與損傷組相比，黃瓜香水提物處理組心肌細(xì)胞搏動增加（P＜0.05），但節(jié)律失常多見，搏動減弱.各處理組對心肌細(xì)胞搏動的影響如表1所示.

表1 各處理組對心肌細(xì)胞搏動的影響（±s，n＝6）

表1 各處理組對心肌細(xì)胞搏動的影響（±s，n＝6）

注 與正常組相比較，a表示P＜0.05；與模型組比較，b表示P＜0.05

組別 劑量／（g·mL－1） 頻率正常組95±24損傷組 24±8a VDG高劑量 2.0 52±14b VDG中劑量 1.0 56±23b VDG低劑量 0.5 57±16b

2.2 黃瓜香水提物對自由基損傷后心肌細(xì)胞存活率的影響

MTT法各處理組對心肌細(xì)胞存活率的影響如表2所示，在自由基損傷前，分別給予不同濃度的黃瓜香水提物預(yù)處理，心肌細(xì)胞存活率分別為57.96%，61.06%，59.29%，與損傷對照組比較有顯著性差異（P＜0.05），其中以1g／mL濃度效果最好.表明自由基損傷心肌細(xì)胞，降低其存活率，而黃瓜香水提物可對抗其損傷作用.

表2 MTT法各處理組對心肌細(xì)胞存活率的影響±s，n＝6）

表2 MTT法各處理組對心肌細(xì)胞存活率的影響±s，n＝6）

注 與正常組相比較，a表示P＜0.05；與模型組比較，b表示P＜0.05

組別 劑量／（g·mL－1） OD值 存活率／%正常組0.452±0.03 100損傷組 0.198±0.08a 43.80a VDG高劑量 2.0 0.262±0.04b 57.96b VDG中劑量 1.0 0.276±0.13b 61.06b VDG低劑量 0.5 0.268±0.06b 59.29b

2.3 黃瓜香水提物對自由基損傷后LDH的影響

各處理組對心肌細(xì)胞LDH活性如表3所示.由表3可見，與正常組相比，自由基組LDH增加（P＜0.05），與損傷組相比，不同濃度的黃瓜香水提物處理組LDH活性降低，其中質(zhì)量濃度為1g／mL效果最好.

表3 各處理組對心肌細(xì)胞LDH活性±s，n＝6）

表3 各處理組對心肌細(xì)胞LDH活性±s，n＝6）

注 與正常組相比較，a表示P＜0.05；與模型組比較，b表示P＜0.05

組別 劑量／（g·mL－1）LDH／（U·L－1）正常組4.42±0.43損傷組 43.56±4.28a VDG高劑量 2.0 31.13±2.34b VDG中劑量 1.0 24.26±2.13b VDG低劑量 0.5 26.16±4.26b

3 討論

（1）心血管疾病是危害人類健康和生命的嚴(yán)重疾病，其發(fā)病率呈不斷上升的趨勢，嚴(yán)重地影響著人們的生活質(zhì)量及生命安全，尤其是缺血性心臟病.LDH作為機(jī)體能量代謝中重要的一種酶，其質(zhì)和量的改變直接影響機(jī)體的能量代謝，心肌缺血后，心肌細(xì)胞膜受損，LDH作為細(xì)胞漿中的酶可大量溢出，因此血清中LDH水平可作為判斷心肌細(xì)胞膜損傷的間接指標(biāo).黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤生成超氧陰離子和過氧化氫，可對細(xì)胞造成損傷.

（2）黃瓜香藥源充足，來源豐富，取材方便，有著悠久民間使用歷史，具有極好的開發(fā)利用前景.

（3）黃瓜香水提物預(yù)處理可以明顯提高自由基損傷后心肌細(xì)胞的存活率，減少LDH漏出，從而表明黃瓜香水提物具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，使細(xì)胞損傷減輕，增加活力，其機(jī)制可能與抗氧化、清除自由基有關(guān).

［1］ 路培培，劉俊田，劉 娜，等.鹿銜草總黃酮對大鼠急性心肌缺血的影響［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，31（5）：581－83.

［2］ 彭湘萍，彭振宇，彭英福，等.黃瓜香提取物對大鼠急性心肌缺血的實驗研究［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2011，20（171）：36－37.

［3］ 王達(dá)理，曾愛萍，南柏松.紅花水提物抗自由基保護(hù)心肌細(xì)胞的作用［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001，7（2）：34－35.

（責(zé)任編輯 陳炳權(quán)）

Experimental Study on the Influence of Viola Diffusa Ging Extract on Myocardial Cells

HE Xuan，PENG Guan－yong，HUANG Lu－lu，WANG Yun－zhao，LIU Jin，PENG Xiang－ping，LI Chun－yan
（Medical College of Jishou University，Jishou 416000，Hunan China）

Objective：to study the influence of viola diffusa gine（VDG）extract on myocardial cells.Methods：myocardial cells were cultured with different concentrations of VDG extract to intervene.The myocardial cells pulse frequency and the contents of lactate dehydrgenase（LDH）in culture solution were determined.MTT method was used to observe the cells survival rate.Results：free radicals injured myocardial cell，VDG extract reduced LDH leakage and increased the cell survival rate（P＜0.05）.Conclusion：The results indicate that VDG extract has a certain protective effects on myocardial cells injured by free radicals.

Viola diffusa Ging（VDG）；myocardial cells；free radicals

R285.5

A

10.3969／j.issn.1007－2985.2013.03.014

1007－2985（2013）03－0066－03

2013－04－25

湖南省大學(xué)生創(chuàng)新性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃資助項目（湘教通（2011）272號）；吉首大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗資助項目（JSU－CX－2011－36）

何 軒（1988－），男（白族），湖南吉首人，吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)學(xué)生

李春艷（1965－），女（土家族），湖南龍山人，吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授，主要從事高等醫(yī)學(xué)教育和湘西民族藥物研究.E－mail：lchy1965＠163.com.