林也容 周龍 吳芳芳 李娟 張?zhí)m 黃麗玲 陳慧 郁毅剛

急性胎兔宮內(nèi)窘迫模型腦NO、iNOS和T-SOD變化實驗研究

林也容 周龍 吳芳芳 李娟 張?zhí)m 黃麗玲 陳慧 郁毅剛

目的 建立孕兔宮內(nèi)窘迫模型, 探討胎兔腦一氧化氮(NO)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)含量變化規(guī)律。方法 新西蘭大白孕兔30只, 隨機分為空白對照組(n=12)、假手術(shù)組(n=9)和宮內(nèi)缺血缺氧組(n=9), 宮內(nèi)缺血缺氧組建立孕兔開腹子宮動脈結(jié)扎胎兔宮內(nèi)窘迫缺血缺氧模型, 分別開腹取各組胎兔腦勻漿液測定NO、iNOS和T-SOD含量, 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。結(jié)果 與空白對照組比較, 假手術(shù)組和宮內(nèi)缺血缺氧組 NO、iNOS的含量顯著升高(P＜0.01), T-SOD的含量明顯降低(P＜0.01), 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與假手術(shù)組相比, 宮內(nèi)缺血缺氧組NO、iNOS顯著升高(P＜0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；T-SOD降低不顯著(P=0.399)。 結(jié)論 通過檢測孕兔宮內(nèi)窘迫模型NO、iNOS和T-SOD顯示, 胎兔缺氧應(yīng)激反應(yīng)強烈, 手術(shù)操作及子宮動脈結(jié)扎對腦組織內(nèi)自由基含量影響顯著。

孕兔；子宮動脈結(jié)扎；宮內(nèi)缺血缺氧；一氧化氮；誘生型一氧化氮合酶；超氧化物歧化酶

胎兒窘迫(fetal distress, FD)是圍產(chǎn)期新生兒事件最主要病因, 造成死產(chǎn)、新生兒缺血缺氧性腦病( hypoxie-ischemic encephalopathy, HIE),甚至進(jìn)一步危及母體。缺血缺氧引起的中、重度新生兒腦損傷, 導(dǎo)致腦癱、癲癇以及發(fā)育遲滯等嚴(yán)重的后遺癥, 給社會、家庭和個人帶來沉重負(fù)擔(dān)。FD造成的新生兒損害是全身系統(tǒng)性的, 根據(jù)其病理特點建立科學(xué)合理的動物模型, 是深人研究FD乃至HIE發(fā)病機制、治療方案的基礎(chǔ)。本研究通過建立胎兔FD模型, 研究HIE新生兔腦早期NO、iNOS和T-SOD。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、動物及試劑 30只健康成年新西蘭大白兔4周左右孕兔, 普通級。體質(zhì)量3.2～3.7 kg, 由上海松江松聯(lián)實驗動物場生產(chǎn), 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。動物許可證：SCXK(滬)2007-0011。實驗動物使用單位許可證編號：SYXK(軍)2002-47。動物實驗人員資質(zhì)許可證編號：軍動管字第2006E01028。氧自由基試劑盒購自南京建成生物工程研究所。分光光度計(722S, 福建新大陸), 溫度濕度計(HTC-1數(shù)字溫度濕度計, 漳州安德培), 鼠兔解剖臺、手術(shù)器械若干。

1.2 實驗分組 實驗分組：實驗孕兔飼養(yǎng)3 d, 每日傍晚測體溫、脈搏、呼吸1次。至孕32～34 d實驗, 剔除異常極值動物, 經(jīng)統(tǒng)計分析, 個體間無明顯差異。編號按隨機表分成3組, 空白組12只, 假手術(shù)對照組9只, 缺血缺氧腦病組9只。

1.3 實驗方法 模型制作：妊娠34 d孕兔以2.5%戊巴比妥鈉0.1 ml/100 g進(jìn)行腹腔麻醉后, 恥區(qū)下腹部正中切口打開腹腔, 暴露雙側(cè)子宮角, 檢查胎盤、子宮及孕兔活力。分離出進(jìn)入每個胎盤的分支動靜脈血管, 用無創(chuàng)性血管夾鉗夾此分支血管, 持續(xù)20 min, 然后松開血管夾, 恢復(fù)血流, 對胎兔進(jìn)行處死、取腦。假手術(shù)組胎兔, 在分離出進(jìn)人每個胎盤的分支血管后, 不進(jìn)行鉗夾, 20 min后直接處死、取腦?？瞻捉M對照組胎兔不做任何處理, 直接處死、取腦。

1.4 觀察指標(biāo) A014 -1 iNOS分型試劑盒, A012 NO試劑盒(硝酸還原酶法), A001-1 羥胺法SOD試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供, 嚴(yán)格按其說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理,采用One-Way ANOVA Test統(tǒng)計分析, 方差不齊時非參數(shù)法秩和檢驗Kruskal-Wallis Tset(H檢驗), 組間均數(shù)用Bonferroni法兩兩比較, 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, P＜0.05視作差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 。

2 結(jié)果

空白對照組、假手術(shù)組和宮內(nèi)缺血缺氧組3組胎兔腦組織iNOS、NO和T-SOD含量之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。宮內(nèi)缺血缺氧組腦組織NO、iNOS含量較空白和假手術(shù)組均明顯升高(P＜0.01)；而假手術(shù)組上述指標(biāo)也高于空白對照組(PiNOS＜0.01, PNO=0.07)。與空白對照組比較, 假手術(shù)組和宮內(nèi)缺血缺氧組T-SOD的含量明顯降低(P＜0.01), 見表1。

表1 胎兔腦早期iNOS、NO和T-SOD含量

表1 胎兔腦早期iNOS、NO和T-SOD含量

注：a與空白對照組和假手術(shù)組比較, P＜0.01；b與空白對照組比較, P＜0.01；c與空白對照組比較, P＜0.01。

分組例數(shù)iNOS(U/ml) NO(μmol/L) T-SOD(U/ml) x-±s秩x-±s x-±s秩x-±s x-±s秩x-±s空白對照組1273.99±42.126.40±4.3097.30± 30.608.05±4.88209.17±10.6524.95±3.91假手術(shù)組9167.27±66.5216.20±6.19b162.70± 97.2414.45±8.19b184.88±13.2312.70±5.50c宮內(nèi)缺血缺氧組9290.42±134.3723.90±4.68a287.00±110.9924.00±3.94a167.51±25.568.85±6.86c

3 討論

胎兒宮內(nèi)窘迫是指胎兒在子宮內(nèi)因為缺血缺氧和酸中毒導(dǎo)致危及其健康和生命的綜合癥, 可致新生兒窒息。窒息可導(dǎo)致新生兒低氧血癥和混合性酸中毒, 是圍生期胎兒及新生兒死亡的重要原因之一。

新生兒窒息是圍生期常見病, 窒息時缺氧導(dǎo)致機體的損害是全身性和多臟器的, 以腦、心臟、腎臟等臟器為主［1］。新生兒各臟器尚處于發(fā)育中, 其對HIE及再灌注后的反應(yīng)與成人并不完全一致。本研究擬以妊娠生理、胎盤發(fā)育與人類相似的兔為研究對象, 探尋一種新的新生兒宮內(nèi)窘迫后腦損傷的動物模型。

缺氧缺血性腦病仍然是圍產(chǎn)兒神經(jīng)損傷的主要原因之一。盡管近年來國內(nèi)外許多學(xué)者對成人缺血性腦損害做了大量的工作, 也取得了較大成就, 但由于胎兒的特殊性, 不能簡單地由此推延應(yīng)用到胎兒上。對胎兒缺氧缺血性腦損害的分子學(xué)發(fā)病機制仍然知之不多, 尚無理想的防治方法。

新生兒窒息的本質(zhì)是缺氧, 可反射性引起全身血流的重新分布, 胃腸道、腎臟、皮膚血流減少。張衛(wèi)生等［2,3］研究顯示窒息后腎血液灌注量明顯降低, 可能由于窒息缺氧時機體自身保護(hù)機制, 為保證腦、心等重要器官的血供, 而非重要生命器官如腎、皮膚等血流收縮引起腎臟的血流灌注不足所致, 而腎臟本身代謝率高, 腎血流量大, 故腎損傷發(fā)生率極高。但目前國內(nèi)外尚無經(jīng)典模型用于此方面的研究, 因而對其發(fā)病機制的探討受到限制, 也為臨床診治造成制約。

本研究參照Mamoru等［4］的方法建立此模型。新生兒窒息80%～90%發(fā)生于產(chǎn)時和宮內(nèi), 而此模型通過對近足月兔阻斷子宮血管而誘發(fā)短期胎盤缺血, 其損傷時間和誘導(dǎo)方式可提供一個與圍生期窒息相似的表現(xiàn)。該模型過去一直應(yīng)用于宮內(nèi)發(fā)育遲緩的研究, 近年來人們開始利用它研究宮內(nèi)窘迫時腎損傷, 對于腦損傷的研究國內(nèi)外報道甚少。以往對新生兒窒息后臟器損傷的研究多借助結(jié)扎一側(cè)頸總動脈后吸入低水平氧的動物模型, 顯然這一模型與新生兒窒息后臟器損傷的發(fā)生過程并不一致。本研究模型通過鉗夾供應(yīng)子宮的動脈和血管, 造成胎兔全身HIE, 與人類窒息后的病理生理過程更為相似, 有人利用此模型對腦損傷的研究亦取得滿意的結(jié)果［5,6］。故此模型是研究宮內(nèi)窘迫后腦損傷較理想動物模型。

顱腦損傷后早期iNOS、NO和T-SOD含量, 能夠反映顱腦損傷后繼發(fā)性損害的病情［7］。iNOS在正常生理狀態(tài)下基因不表達(dá), 當(dāng)受到缺血缺氧的應(yīng)激因素的刺激后即被激活,進(jìn)一步NO的生成。高水平的NO參與機體炎癥、免疫應(yīng)答中起細(xì)胞毒與細(xì)胞抑制作用的病理生理過程, 引起腦組織和細(xì)胞損害［8］。T-SOD是存在于生物體內(nèi)的重要的抗氧化酶系［9］, 參與抗氧化的病理保護(hù)過程。

綜上所述, 通過檢測孕兔宮內(nèi)窘迫模型兔腦NO、iNOS和T-SOD含量變化, 能夠提示胎兔缺氧應(yīng)激反應(yīng)的嚴(yán)重程度, 手術(shù)操作及子宮動脈結(jié)扎對腦組織內(nèi)自由基含量影響顯著。

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Experimental research on the changes of NO iNOS and T-SOD of brain tissue on acute intrauterine hypoxia in pregnant rabbit model

LIN Ye-rong, ZHOU Long, WU Fang-fang, et al.Department of Obstetrics and Gynecology, 175th Hpspital of PLA Dongnan Hospital Affiliated to Xiamen University, Zhangzhou 363000, China

Objective To Study the changes of NO、iNOS and T-SOD in pregnant rabbits brain tissue after build acute intrauterine hypoxia m odel.Methods 30 New Zealand white pregnant rabbits were randomly divided into 3 groups, blank group(n=12), sham operated group(n=9) and intrauterine ischemia hypoxia group(n=9), according to uterine artery ligation and erecting uterine ischemia hypoxia models.The contents of NO, iNOS and T-SOD in pregnant rabbits brain homogenate were measured and compared.Results Compared with the blank group, the contents of NO and iNOS were significantly increased in sham operated group and intrauterine ischemia hypoxia group(P＜0.01), the contents of T-SOD were significantly decreased(P＜0.01).Compared with sham operated group, the contents of NO and iNOS were significantly increased in intrauterine ischemia hypoxia group(P＜0.01), but the contents of T-SOD were not significantly decreased(P=0.399).Conclusion All pregnant rabbits have an s trong stress response, after the operative procedure and uterine artery ligation, they have an significant effect upon the contents of NO, iNOS and T-SOD in pregnant rabbits brain tissue.

Pregnant rabbit； Uterine artery ligation； Intrauterine ischemia hypoxia； NO； iNOS； T-SOD

福建省自然科學(xué)基金(項目編號：2007J0302)；全軍十一五醫(yī)學(xué)科研基金面上項目(項目編號：06MB152)；福建省科技計劃青年人才項目(項目編號：2006F3150)；福建省漳州市科技計劃項目(項目編號：Z10071)

363000 漳州,解放軍第一七五醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院婦產(chǎn)科(林也容 吳芳芳 李娟 張?zhí)m 黃麗玲 陳慧)；神經(jīng)外科(周龍 郁毅剛)

林也容 E-mail：yu-yg@tom.com