鄭 琪， 徐秉良， 薛應(yīng)鈺， 梁巧蘭， 張 瑾

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）

杏（Armeniaca vulgaris Lam.）屬肉質(zhì)多汁果實(shí)，成熟期集中，采摘后不耐貯藏，極易受到病原菌侵染而發(fā)生采后病害，造成的腐爛率高達(dá)50%［1］。由細(xì)交鏈孢（Alternaria tenuis Nees）引起的黑斑病和灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）引起的灰霉病是杏采后貯藏期間的主要病害［2－3］。國(guó)內(nèi)外防治果實(shí)采后病害的方法主要有：低溫貯藏、氣調(diào)貯藏、熱處理以及化學(xué)藥劑處理等，但物理方法成本高，儀器設(shè)備復(fù)雜，化學(xué)防治使病原菌抗藥性增加，果品農(nóng)藥殘留危害人體健康。自Pusey［4］首次使用B.subtilis防治桃褐腐病以來(lái)，生物防治以其安全、無(wú)殘毒、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)逐漸成為一種控制果蔬采后病害的新途徑被人們所重視。國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道從蘋(píng)果、草莓、柑橘、油桃等水果上篩選到幾十種拮抗菌防治采后病害［5］，但利用拮抗菌防治杏采后病害的報(bào)道卻很少。因此，本試驗(yàn)從生物防治角度出發(fā)，旨在從杏果實(shí)表面、葉片及根際土壤中分離篩選出對(duì)細(xì)交鏈孢和灰葡萄孢具有明顯拮抗作用的菌株，為杏采后病害的生物防治打下基礎(chǔ)，以延長(zhǎng)果實(shí)的貯藏期。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇剛采摘的大小一致的成熟健康杏果實(shí)，放置于貯藏室（25℃）內(nèi)。PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基參照方中達(dá)［6］的方法制備。

1.2 方法

1.2.1 杏采后病害病原菌的分離及致病性測(cè)定

采用常規(guī)的組織分離法［6］，分別對(duì)貯藏后7、9、11、13d的發(fā)病杏果實(shí)進(jìn)行病原菌的分離，并計(jì)算分離頻率。初次分離后的菌種采用單孢分離法進(jìn)行純化，并將純化后的菌株保存在PDA斜面上備用。采用刺傷接種和無(wú)傷接種的方法［7］，對(duì)病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。

1.2.2 拮抗菌的分離

1.2.2.1 土壤稀釋分離法

參照徐雪蓮［8］的方法，土壤采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)杏園，除去果樹(shù)根際表層5cm左右的浮土，取5～10cm處的土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干、過(guò)篩、混勻，每份土樣稱取10g，置于90mL無(wú)菌水中，加入小玻璃珠，在150r／min的搖床上振蕩30min，制成土壤懸浮液，用梯度稀釋法稀釋到1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7后涂布于 NA平板上，30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3d，記錄菌株生長(zhǎng)情況，然后挑取菌落形態(tài)差異明顯的單個(gè)菌落純化培養(yǎng)。

1.2.2.2 果實(shí)及植物表面拮抗菌的分離

參照J(rèn)anisiewicz［9］的方法，將杏樹(shù)葉片及果實(shí)表皮分別置于0.05mol／L磷酸緩沖液中，100r／min搖床振蕩10min，將洗液梯度稀釋為1×10－1、1×10－2、1×10－3后，在 NA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌株生長(zhǎng)情況，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單個(gè)菌落純化培養(yǎng)。

1.2.2.3 杏果實(shí)傷口處拮抗菌的分離

按照Wilson等［10］的方法分離，選取10個(gè)杏果實(shí)，在每個(gè)果實(shí)的陰陽(yáng)面各刺一個(gè)3mm×5mm的傷口，再用150mL無(wú)菌水分別沖洗10個(gè)無(wú)傷口的杏健康果實(shí)2次，取50μL洗液接種在傷口內(nèi)，2h后接種20μL 1.0×104個(gè)／mL的病原菌孢子懸浮液，25℃、相對(duì)濕度RH＜95%條件下貯藏5d后，切取未侵染的傷口組織，在10mL無(wú)菌水中研磨均勻，取研磨液用稀釋平板法分離獲得單個(gè)菌落，純化培養(yǎng)。

1.2.3 杏采后病害病原拮抗菌的篩選

1.2.3.1 離體篩選

采用PDA 平板對(duì)峙法［11］，在平板（90mm）中央分別點(diǎn)接A.tenuis和B.cinerea（d＝5mm）為指示菌，將已分離純化的菌株分別點(diǎn)接在距離指示菌3cm處的4個(gè)角點(diǎn)上，以不接拮抗菌株的為對(duì)照，28℃恒溫箱培養(yǎng)5～7d，觀察記錄，選取對(duì)病原菌有較強(qiáng)抑制作用的菌株進(jìn)行復(fù)篩，比較抑制效果R值的大小，篩選出抑菌效果好的菌株。每處理4次重復(fù)。計(jì)算公式如下：

1.2.3.2 活體篩選

參照班兆軍［5］的方法，選擇剛采摘的大小一致的成熟健康杏果實(shí)，用2%的NaClO溶液消毒2min，然后用無(wú)菌水沖洗掉殘余的NaClO后自然晾干。在果實(shí)腰部刺一個(gè)直徑3mm，深3mm的孔，先接種1×108cfu／mL拮抗菌菌懸液30μL，2h后再接種1×104個(gè)／mL病原菌孢子懸浮液30μL，對(duì)照組加入無(wú)菌水和對(duì)應(yīng)的病原菌孢子懸浮液；待果實(shí)風(fēng)干后置于果品周轉(zhuǎn)箱中，用保鮮膜進(jìn)行密封，以保持95%左右的相對(duì)濕度，20℃貯藏5d后統(tǒng)計(jì)果實(shí)的發(fā)病率與病斑直徑。每處理10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。

1.2.4 杏采后病害病原拮抗菌的鑒定

1.2.4.1 拮抗菌的培養(yǎng)特征及形態(tài)特征

參照沈萍等［12］的方法，觀察拮抗菌在NA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征及顯微形態(tài)特征。

1.2.4.2 拮抗菌的生理生化特征

按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［13］和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［14］對(duì)拮抗作用較好的拮抗菌進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.4.3 16SrDNA序列測(cè)定及分析

以細(xì)菌基因組柱式提取試劑盒提取的基因組DNA為模板，以Primer1－F5′－ATCCTTGTTACGACTTGA－3′和Primer1－R：5′－AGTTTGATCCTGGCTCA－3′為引物，進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL：模板DNA1μL，Primer1－F和Primer1－R各1μL，滅菌的雙蒸水22μL，Premix Taq 25μL。反應(yīng)條件為：95℃初始變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃復(fù)性15min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果送交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在Gen－Bank上進(jìn)行同源性比對(duì)，參比序列，并利用軟件DNAStar進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建同源性樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏采后病害病原菌及拮抗菌的分離

2.1.1 杏采后病害病原菌的分離

通過(guò)對(duì)不同貯藏時(shí)期的發(fā)病杏果進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，細(xì)交鏈孢和灰葡萄孢的分離頻率最高，分別為39.7%和31.9%，在貯藏7～13d的病果上均可分離到，黑根霉在貯藏13d的果實(shí)上分離頻率也較高，平均分離頻率為18.2%，指狀青霉、粉紅聚端孢霉和黑曲霉的平均分離頻率分別為6.0%、3.4%和0.9%（表1）。

表1 不同貯藏時(shí)期發(fā)病杏果病原菌的分離頻率Table 1 The isolation frequencies of pathogens on the apricot fruits during different storage periods

經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，確定A.tenuis和B.cinerea為杏采后貯藏期間的主要致病菌。

2.1.2 杏采后病害病原拮抗菌的分離

通過(guò)土壤分離法、表面分離法和組織分離法，共從采集的土樣、果實(shí)及葉片上分離到107個(gè)菌株。將107個(gè)菌株分別對(duì)A.tenuis和B.cinerea進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，篩選抑菌帶大于5mm，抑菌效果明顯的菌株。結(jié)果表明，在所分離到的全部菌株中，對(duì)A.tenuis表現(xiàn)明顯抑制作用的菌株共44株，占總分離數(shù)的41.1%，對(duì)B.cinerea具有明顯抑制作用的菌株共有27株，占分離總數(shù)的25.2%；而同時(shí)對(duì)這兩種病原菌具有抑制效果的菌株僅有14株，占分離總數(shù)的13.5%（表2）。

表2 拮抗菌株的分離結(jié)果Table 2 The isolation results of antagonistic bacteria

2.2 杏采后病害病原拮抗菌的篩選

2.2.1 離體篩選

將這14株拮抗菌分別編號(hào)為JK－1～JK－14，進(jìn)行離體篩選，比較R的大小，結(jié)果表明，14株菌對(duì)兩種采后病原菌均有不同程度的抑制作用，尤其以JK－14和JK－11的拮抗作用最顯著，對(duì)A.tenuis的抑制效果R分別為0.74、0.68，拮抗效果最差的是JK－1，R 為0.56，對(duì)B.cinerea的抑制效果分別達(dá)到0.74、0.73，JK－7的拮抗效果最差，R為0.38。方差分析結(jié)果表明，JK－14和JK－11間無(wú)顯著差異，而與JK－1、JK－7形成顯著差異，其余菌株的拮抗效果介于之間（表3）。

2.2.2 活體篩選

將離體篩選效果較好的2株拮抗菌分別對(duì)杏果進(jìn)行活體防效試驗(yàn)，結(jié)果表明，2株拮抗菌對(duì)A.tenuis和B.cinerea均表現(xiàn)出了較高的防效，且JK－14的防效優(yōu)于JK－11。經(jīng)JK－14和JK－11處理5d后的杏果，其A.tenuis的發(fā)病率分別為16.3%和19.3%，病斑直徑分別為4.4、4.7mm，而對(duì)照的發(fā)病率為95.6%，病斑直徑為12.5mm，兩者存在顯著差異。JK－14和JK－11處理杏果5d后B.cinerea的發(fā)病率分別為14.1%和17.0%，病斑直徑分別為3.2、3.4mm，而對(duì)照杏果 B.cinerea 的發(fā)病率為96.3%，病斑直徑為14.9mm，顯著高于處理果實(shí)（表4），而且對(duì)照果實(shí)已出現(xiàn)軟化、局部腐爛等癥狀，在傷口處有明顯病斑形成（圖2）

表3 14株拮抗菌株對(duì)2種病原菌的拮抗性能Table 3 Antagonistic activity of 14bacteria to 2pathogens mm

圖1 2株拮抗菌對(duì)鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的拮抗作用（7d）Fig.1 Antibacterial effects of 2antagonistic bacterial strains on A.tenuis and B.cinerea（7d）

表4 2株拮抗菌株的活體抑制效果Table 4 In vivo inhibitory effects of 2antagonistic bacterial strains

2.3 拮抗菌的鑒定

2.3.1 拮抗菌的形態(tài)特征及理化測(cè)定

JK－14和JK－11在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，28℃下培養(yǎng)2～3d即可出現(xiàn)明顯菌落，其中JK－14的菌落呈橢圓形或不規(guī)則形，乳白偏黃色，菌落不透明，表面粗糙有褶皺，革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體呈桿狀，大小約為0.8μm×2.5μm。JK－11菌落呈現(xiàn)圓形，白色略透明，表面光滑，菌體桿狀，大小為0.9μm×3.2μm，革蘭氏染色陽(yáng)性（圖3）。2株拮抗菌的相關(guān)生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

圖2 兩株拮抗菌對(duì)杏果實(shí)上細(xì)交鏈孢（A.tenuis）灰葡萄孢（B.cinerea）的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of 2antagonistic bacterial strains on A.tenuis and B.cinereain apricot

圖3 兩株拮抗菌的菌體形態(tài)（光學(xué)顯微鏡100倍）Fig.3 Morphological characteristics of the thalli of the strain JK－14and JK－11

2.3.2 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)對(duì)2株拮抗菌進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序，得到JK－14的16SrDNA 的序列長(zhǎng)度為1442bp，JK－11的16SrDNA 的序列長(zhǎng)度為1437bp，2株拮抗菌的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

表5 拮抗菌株JK－14和JK－11的生理生化鑒定結(jié)果Table 5 Physiological and biochemical properties of the strain JK－14and JK－11

圖4 JK－14、JK－11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of PCR amplification product of JK－14and JK－11

將條帶回收測(cè)序后在GenBank上進(jìn)行比對(duì)，選取同源性不低于99%的序列，利用DNAStar軟件繪制其聚類圖譜（圖5），結(jié)果表明：JK－14與多株Bacillus的16SrDNA序列具有很高的同源性，與B.subtilis（HQ317149）、B.subtilis（JQ308571）、B.amyloliquefaciens（HQ179100）的 親 緣 關(guān) 系 最近，位于聚類圖的同一分支，聚為一類；而與JK－11同源性較高的菌株均屬Paenibacillus，與親緣關(guān)系較 近 的 菌 株P(guān).polymyxa（AY302439）、P.polymyxa（FJ940900）和P.polymyxa（EF620470）為同一分支，聚為一類，結(jié)合生理生化測(cè)定的結(jié)果，確定JK－14為芽胞桿菌（Bacillus sp. JK－11為類芽胞桿菌（Paenibacillus sp.

圖5 菌株JK－14、JK－11的遺傳聚類分析圖譜Fig.5 Phylogenetic tree of the isolates JK－14and JK－11

3 結(jié)論與討論

杏采后病害是制約其生產(chǎn)和銷售的重要因素，曹建康［2］對(duì)引起杏采后黑斑病病原菌鏈格孢進(jìn)行了侵染時(shí)期、機(jī)制、防治時(shí)期的研究。張瑾［1］對(duì)杏采后病害病原菌進(jìn)行了分離，其中鏈格孢和灰葡萄孢對(duì)杏果均有一定的致病性。朱子華［3］報(bào)道了引起核果類桃、杏、李、櫻桃采后病害的病原菌，主要有果生鏈核盤菌（Monilinia fructicola），灰葡萄孢（B.cinerea），鏈格孢（A.tenuis）和黑根霉（R.stolonifer）等。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)杏貯藏7～13d的病原菌進(jìn)行分離，結(jié)果表明，A.tenuis和B.cinerea為杏采后貯藏期間的主要病原菌，并針對(duì)這兩種主要病原菌在杏果園土壤、果實(shí)表面及葉片中進(jìn)行了拮抗菌的大量分離，共得到14株對(duì)A.tenuis和B.cinerea都具有抑制作用的菌株，占分離總數(shù)的13.5%。通過(guò)離體和活體篩選，得到兩株拮抗作用較好的菌株JK－14和JK－11，對(duì)A.tenuis的抑菌比值 R 分別為0.74和0.68，對(duì)B.cinerea的抑菌比值為0.74和0.73。處理杏果A.tenuis的發(fā)病率為16.3%和19.3%，病斑直徑為4.4和4.7mm，接種B.cinerea的發(fā)病率為14.1% 和17.0%，病斑直徑分別為3.2和3.4mm，均明顯低于對(duì)照果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。雖然圍繞杏果不同生境進(jìn)行了拮抗菌的大量分離篩選，得到了對(duì)其采后病害具有不同程度抑制作用的菌株，然而，對(duì)兩種病原菌同時(shí)具有明顯抑制效果的菌種卻相對(duì)較少，因此，今后還可以從更廣泛的不同生境中進(jìn)行分離篩選，以擴(kuò)大拮抗菌的篩選源。

JK－14和JK－11對(duì)杏果實(shí)采后病原菌A.tenuis和B.cinerea具有顯著的抑制效果，是較好的生防菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)，生理生化及分子生物學(xué)方法對(duì)這兩株拮抗菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果為JK－14屬芽胞桿菌（Bacillus sp.），JK－11為類芽胞桿菌（Paenibacillus sp.）。由于Bacillus和Paenibacillus部分種之間的同源性很高，難以通過(guò)16SrDNA序列分析和生化特征予以區(qū)分。因此，還應(yīng)結(jié)合gyrA、gyrB基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)兩株拮抗菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

關(guān)于拮抗菌防治果蔬病害已有大量報(bào)道，楊振［15］將分離出的枯草芽胞桿菌BS－331防治油桃果實(shí)采后綠霉病和軟腐病，效果較好；陳浩等［16］發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌B－FS01對(duì)葡萄霜霉病的防效顯著；多黏類芽胞桿菌作為一種潛在的，有價(jià)值的生防菌株也逐漸受到人們關(guān)注，陳文?。?7］等報(bào)道從西瓜根際分離出的多黏類芽胞桿菌，對(duì)番茄早疫病菌、草莓炭疽病等病原菌均具有明顯的抑菌作用。但利用拮抗菌防治杏采后病害卻很少有報(bào)道。本試驗(yàn)篩選出的這兩株拮抗菌對(duì)杏采后主要病害防治效果顯著，具有很好的應(yīng)用和發(fā)展前景。因而，有必要對(duì)其防腐抑菌機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

［1］ 張瑾，徐秉良，梁巧蘭，等.杏采后病害病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選［J］.植物保護(hù)，2011，37（5）：118－123.

［2］ 曹建康.杏采后黑斑病潛狀侵染時(shí)期、機(jī)制及控制［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［3］ 朱子華，盛恒彬，梅象信，等.果實(shí)采后病害種類［J］.河南林業(yè)科技，2004，24（4）：17－18.

［4］ 游春平，肖愛(ài)平，鄭小波，等.產(chǎn)后果實(shí)病害生物防治的研究進(jìn)展［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2005，32（2）：214－215.

［5］ 班兆軍，李莉，李喜宏，等.隱球酵母對(duì)長(zhǎng)棗果實(shí)的生防效果及誘導(dǎo)抗性［J］.植物保護(hù)，2009，35（3）：77－80.

［6］ 方中達(dá).植病研究方法［M］.第3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［7］ 趙淑艷，李喜宏，陳麗，等.桃采后病原菌種類及侵染規(guī)律研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（10）：253－255.

［8］ 徐雪蓮.果蔬采后病害拮抗細(xì)菌的篩選及研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［9］ Janisiewicz W J.Biocontrol of postharvest diseases of apples with antagonist mixtures［J］.Phytopathology，1988，78：194－198.

［10］Wilson C L，Wisniewski M E，Droby S，et al.A screen strategy for microbial antagonist to control postharvest disease of fruits and vegetables［J］.Scientia Horticulturae，1993，53：183－189.

［11］胡青平.番茄早疫病菌（Alternaria solani）廣譜拮抗微生物的選育及拮抗機(jī)理研究［D］.西安：西北大學(xué)，2008.

［12］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京：高等教育出版社，1999.

［13］布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)：中文版（8版）［M］.中國(guó)科學(xué)院微生物所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

［14］東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［15］楊振，郭紅蓮，張曉波，等.枯草芽孢桿菌BS－331防治油桃采后病害的研究［J］.中國(guó)果樹(shù)，2008，11（6）：35－38.

［16］陳浩，胡梁斌，唐春平，等.枯草芽胞桿菌B－FS01對(duì)葡萄霜霉病的防治效果［J］.植物保護(hù)，2011，37（6）：194－197.

［17］陳文俊，曾蓉，陸金萍，等.西瓜根際細(xì)菌JK－3的鑒定及其拮抗性的初步研究［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（1）：68－72.