曹學(xué)照 劉 芳 馬 虹 (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 000)

手術(shù)和麻醉后，很多老年患者出現(xiàn)認(rèn)知功能下降，被稱之為術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)。許多病理生理機(jī)制已用于解釋POCD的可能機(jī)制，但確切的機(jī)制仍不明確。手術(shù)創(chuàng)傷、麻醉和應(yīng)激可導(dǎo)致患者術(shù)前非特異性炎癥反應(yīng)。炎性因子在手術(shù)和創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)中起到重要作用。本研究擬探討手術(shù)創(chuàng)傷對海馬區(qū)炎性因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 成年鼠和老年鼠手術(shù)創(chuàng)傷模型的建立 雄性成年SD大鼠(3～6月齡)和老年SD大鼠(18～20月齡)分別隨機(jī)分為對照組(12只)、麻醉組(36只)和手術(shù)組(36只)。所有實(shí)驗(yàn)動物都維持室溫23℃，黑白周期12 h輪轉(zhuǎn)，給與充足的食物和水。所有動物都在這樣的環(huán)境熟悉7～10 d。對照組SD大鼠不做特殊處理。麻醉組實(shí)驗(yàn)動物單純接受1.5%～2%異氟烷麻醉，行氣管插管和機(jī)械通氣。手術(shù)組SD大鼠行肝部分切除術(shù)。具體步驟:手術(shù)切口處備皮、消毒，在上腹部正中線做一小切口，游離切除左側(cè)肝臟，傷口用0.25%布比卡因浸潤，然后用縫線縫合，所有手術(shù)步驟均無菌操作。實(shí)驗(yàn)鼠在術(shù)后1、3、7 d檢測海馬區(qū)白介素(IL)-1β，IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA和蛋白表達(dá)變化。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測大鼠術(shù)后1、3、7 d海馬區(qū)炎性因子mRNA的表達(dá)

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物，由大連Takara公司合成引物序列(見表1)。

1.2.2 兩步法RT-PCR (1)反轉(zhuǎn)錄為cDNA:cDNA的合成主要利用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒合成。(2)PCR 反應(yīng):反應(yīng)體系為 40 μl(5 × 緩沖液10 μl，dNTP 4 μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5 μl，Taq聚合酶0.25μl，ddH2O28.75 μl，cDNA 產(chǎn)物 2 μl)。反應(yīng)條件:退火溫度按各引物要求變化，其余反應(yīng)條件相同。(3)PCR產(chǎn)物檢測:PCR反應(yīng)結(jié)束后，用5 μl PCR產(chǎn)物和1 μl GeneFinderTM染料混合，上樣至2%瓊脂糖凝膠，以100 bp DNA Ladder Marker(TaKaRa，中國)作為DNA片段長度標(biāo)記，150 V電壓下電泳45 min，利用凝膠成像系統(tǒng)，確定是否擴(kuò)增出目的條帶。mRNA的量由特異性基因mRNA和β-actin mRNA的比值來表示。

1.3 免疫蛋白印跡雜交測定IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)分別裂解各組細(xì)胞，收集上清，測定蛋白質(zhì)濃度，然后按每個電泳孔道加入50 μg蛋白混合樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。先后加入一抗(IL-1β、IL-6、TNF-α)和二抗(羊抗兔單克隆抗體)進(jìn)行雜交。然后進(jìn)行酶標(biāo)染色顯色，應(yīng)用圖像分析軟件分析各電泳條帶的蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料組間比較行兩因素方差分析，Student t檢驗(yàn)。所得數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)創(chuàng)傷對海馬區(qū)炎性因子mRNA表達(dá)的影響 兩因素方差分析海馬區(qū)炎性因子 mRNA的表達(dá)顯示，時間(P＜0.001)和年齡(P＜0.001)在IL-1β，IL-6和 TNF-α mRNA上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)，成年鼠和老年鼠海馬區(qū) IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA在基礎(chǔ)水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.041，P=0.012和P=0.035)，蛋白水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單純麻醉因素沒有明顯改變成年鼠和老年鼠海馬區(qū)炎性因子的表達(dá)。成年鼠海馬區(qū)IL-1β和 IL-6 mRNA僅在手術(shù)后第1天(P＜0.001)明顯增高，但老年鼠海馬區(qū)IL-1β和IL-6 mRNA增多持續(xù)到手術(shù)后3 d(P＜0.001)(表2)。TNF-α mRNA僅在老年鼠手術(shù)后1 d(P＜0.001)明顯增加，在成年鼠沒有明顯改變(P=0.095)(表2)。這些結(jié)果證明手術(shù)創(chuàng)傷可明顯增加海馬區(qū)炎性因子的表達(dá)，這種改變尤其在老年鼠明顯，老年鼠海馬區(qū)炎性因子表達(dá)上調(diào)更明顯，持續(xù)時間更長。見圖1。

2.2 手術(shù)創(chuàng)傷對海馬區(qū)炎性因子蛋白表達(dá)的影響 利用兩因素方差分析海馬區(qū)炎性因子蛋白的表達(dá)顯示，時間(P＜0.001)和年齡(P＜0.001)在IL-1β，IL-6和 TNF-α蛋白上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)，成年鼠和老年鼠海馬區(qū)IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA蛋白在基礎(chǔ)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IL-1β和 IL-6蛋白僅老年鼠在術(shù)后第1天表達(dá)增加(P＜0.01;P＜0.05)，第3天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TNF-α蛋白在成年和老年鼠術(shù)后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖1。

圖1 手術(shù)創(chuàng)傷對海馬區(qū)炎性因子蛋白表達(dá)

表1 各引物序列及擴(kuò)增長度

表2 手術(shù)創(chuàng)傷對海馬區(qū)炎性因子mRNA表達(dá)(±s，n=12)

表2 手術(shù)創(chuàng)傷對海馬區(qū)炎性因子mRNA表達(dá)(±s，n=12)

與成年鼠比較:1)P＜0.05;與各自年齡段對照組比較:2)P＜0.001

1.39±0.63 1.04±0.23老年 1.26±0.201) 5.73±0.652) 3.73±0.502) 1.26±0.21 IL-6 成年 0.98±0.23 2.29±0.342) 1.285±0.14 1.08±0.24老年 1.22±0.221) 3.43±0.252) 2.25±0.152) 1.16±0.21 TNF-α 成年 0.58±0.12 0.80±0.21 0.64±0.11 0.570.09老年 0.79±0.111) 1.28±0.142)P1 P3 P7 IL-1β 成年 1.01±0.25 3.13±0.852)對照組0.87±0.08 0.74±0.10

表3 手術(shù)創(chuàng)傷對海馬區(qū)炎性因子mRNA表達(dá)(±s，n=12)

表3 手術(shù)創(chuàng)傷對海馬區(qū)炎性因子mRNA表達(dá)(±s，n=12)

與成年鼠比較:1)P＜0.05;與各自年齡段對照組比較:2)P＜0.001

0.78±0.15 1.43±0.76 0.87±0.53 0.84±0.27老年 0.80±0.22 1.78±0.651)1.35±0.31 0.88±0.23 IL-6 成年 0.76±0.27 1.29±0.36 0.87±0.12 0.82±0.20老年 0.78±0.25 1.92±0.282)1.02±0.14 0.86±0.23 TNF-α 成年 0.53±0.11 0.65±0.20 0.58±0.13 0.56±0.11老年P(guān)1 P3 P7 IL-1β 成年對照組0.65±0.10 0.71±0.14 0.74±0.11 0.68±0.12

3 討論

本實(shí)驗(yàn)探討了手術(shù)創(chuàng)傷對成年鼠和老年鼠海馬區(qū)炎性因子表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)證實(shí)手術(shù)創(chuàng)傷引起了成年鼠和老年鼠海馬區(qū)IL-1β，IL-6和TNF-α表達(dá)的增加。與成年鼠相比，老年鼠海馬區(qū)炎性因子表達(dá)更強(qiáng)烈，持續(xù)時間更長。炎性因子表達(dá)變化與實(shí)驗(yàn)鼠認(rèn)知功能障礙變化相一致。炎性因子可能介導(dǎo)了實(shí)驗(yàn)鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙。許多病理生理機(jī)制已用于解釋POCD的可能機(jī)制，但確切機(jī)制仍不明確。已有報道手術(shù)創(chuàng)傷、麻醉和應(yīng)激可導(dǎo)致患者術(shù)前非特異性炎癥反應(yīng)〔1〕。炎性因子在手術(shù)和創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)中起到重要作用。以前的動物實(shí)驗(yàn)顯示通過注射脂多糖(LPS)激活外周免疫系統(tǒng)可引起外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，如IL-1，IL-6，TNF-α，這些炎性因子可通過直接或者間接的機(jī)制影響認(rèn)知功能〔2〕。海馬區(qū)激活的膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎性因子可導(dǎo)致記憶和學(xué)習(xí)能力的下降，以及長時程增強(qiáng)(LTP)的破壞。與年齡相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞活性的改變可加劇老年患者炎癥反應(yīng)的程度〔3〕，所以老年人術(shù)后容易出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。與成年鼠相比，激活中樞神經(jīng)免疫系統(tǒng)，老年鼠更容易發(fā)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能破壞〔4〕。

炎性因子就如同一把雙刃劍，它既能保護(hù)神經(jīng)功能，但過量或者長期表達(dá)也能起到破壞作用。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量炎性因子表達(dá)可導(dǎo)致運(yùn)動協(xié)調(diào)功能和認(rèn)知功能的破壞〔5〕。海馬區(qū)是腦內(nèi)炎性因子受體表達(dá)的聚居區(qū)，似乎對過量的或者慢性炎性因子表達(dá)更敏感〔6〕。在正常生理情況下，炎性因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)不存在。但在病理狀態(tài)下表達(dá)迅速升高。炎性因子可結(jié)合中樞神經(jīng)系統(tǒng)相應(yīng)的受體，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起一系列的炎癥反應(yīng)和其他效應(yīng)〔6〕。

阻滯腦內(nèi)炎性因子受體可以改善因激活外周免疫系統(tǒng)引起的行為學(xué)抑制。文獻(xiàn)證實(shí)外源性的IL-1β能夠引起免疫反應(yīng)和認(rèn)知功能破壞，但側(cè)腦室注射IL-1β受體拮抗劑可改善破壞的認(rèn)知功能，給予IL-6受體拮抗劑能延長LTP，改善空間記憶能力和改善由于LPS引起的行為學(xué)抑制〔7〕。這些研究證實(shí)了炎性因子在調(diào)節(jié)行為學(xué)和認(rèn)知功能方面的重要作用。

綜上所述，手術(shù)創(chuàng)傷引起了成年鼠和老年鼠海馬區(qū)炎性因子表達(dá)增加，加上我們前期試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)手術(shù)創(chuàng)傷引起了成年鼠和老年鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害，炎性因子可能介導(dǎo)了實(shí)驗(yàn)鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙。

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2 Thomson LM，Sutherland RJ.Systemic administration of lipopolysaccharide and interleukin-1beta have different effects on memory consolidation〔J〕.Brain Res Bull，2005;67(1):24-9.

3 Godbout JP，Johnson RW.Age and neuroinflammation:a lifetime of psychoneuroimmune consequences〔J〕.Neurol Clin，2006;24(3):521-38.

4 Chen J，Buchanan JB，Sparkman NL，et al.Neuroinflammation and disruption in working memory in aged mice after acute stimulation of the peripheral innate immune system〔J〕.Brain Behav Immun，2008;22(3):301-11.

5 Griffin WS，Liu L，Li Y，et al.Interleukin-1 mediates Alzheimer and Lewy body pathologies〔J〕.J Neuroinflammation，2006;3(5):5-14.

6 Parnet P，Kelley KW，Bluthe RM，et al.Expression and regulation of interleukin-1 receptors in the brain:role in cytokines-induced sickness behavior〔J〕.J Neuroimmunol，2002;125(1):5-14.

7 Johnson JD，O'Connor KA，Watkins LR，et al.The role of IL-1beta in stress-induced sensitization of pro-inflammatory cytokine and corticosterone responses〔J〕.Neuroscience，2004;127(3):569-77.