王茂楠 夏 昕 徐松柏 劉玉石 (吉林省人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 3002)

近年來(lái)中國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且以每年4%的幅度遞增，遞增速度為世界平均水平的2倍〔1～3〕。目前，結(jié)腸癌的治療方法主要以手術(shù)為主，輔以局部或全身放、化療，但未能明顯提高結(jié)腸癌的5年生存率，因此傳統(tǒng)的治療方法效果并不理想。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)及基因工程的發(fā)展，使得應(yīng)用基因治療成為提高結(jié)腸癌患者預(yù)后的一種有前景的途徑〔4～6〕。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中PTTG進(jìn)行抑制，并進(jìn)一步觀察PTTG基因沉默對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞株為本研究室保存。陰性對(duì)照干擾質(zhì)粒 pGenesil－2.1－HK siRNA，PTTG 干擾質(zhì)粒pGenesil－2.1－PTTG siRNA由本室構(gòu)建并保存;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 LoVo細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法，按Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 pGenesil－2.1－PTTG siRNA 干擾后 LoVo細(xì)胞中 PTTG 表達(dá) 采用Western blot法，ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后3組細(xì)胞中PTTG蛋白表達(dá)。

1.4 pGenesil－2.1－PTTG siRNA對(duì) LoVo細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/L，用無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基鋪于96孔板上，每孔200 μl(相當(dāng)于5 000個(gè)細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)分3組:正常對(duì)照組、陰性干擾質(zhì)粒組和PTTG干擾質(zhì)粒組，每組6復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO振蕩，并于490 nm下用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光吸收值(A)。

1.5 pGenesil－2.1－PTTG siRNA 對(duì) LoVo 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 將LoVo細(xì)胞用無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基鋪于6孔板上，分組同上。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，1 200 r/min，離心5 min，0.01 mmol/L PBS洗兩次，RNA酶消化，PI(碘化丙腚)4℃避光染色30 min，以流式細(xì)胞儀(BD公司，USA)檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化;用Annexin V－PI FITC凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，將LoVo細(xì)胞加入6孔板24 h后，轉(zhuǎn)染PTTG siRNA干擾質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照及HK陰性對(duì)照組。連續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，每個(gè)樣本取5×105個(gè)細(xì)胞，加450 μl binding buffer重懸細(xì)胞，然后加入2 μl熒光標(biāo)記的 Annexin V和5 μl PI，室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)用Modfit軟件分析，記錄凋亡細(xì)胞百分率。

2 結(jié)果

2.1 pGenesil－2.1－PTTG siRNA 干擾后 LoVo細(xì)胞中 PTTG 蛋白表達(dá) 如圖1所示，Lovo細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGenesil－2.1－PTTG siRNA干擾質(zhì)粒48 h后其內(nèi)PTTG蛋白表達(dá)明顯低于正常和HK陰性對(duì)照組。

圖1 轉(zhuǎn)染PTTG siRNA質(zhì)粒后LoVo細(xì)胞中PTTG蛋白表達(dá)(Western印跡)

2.2 pGenesil PTTG siRNA對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響 MTT比色分析法顯示，pGenesil PTTG siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞后，在24、48和72 h細(xì)胞增殖能力均顯著低于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照HK組(均P＜0.01)(表1)。

表1 轉(zhuǎn)染PTTG siRNA質(zhì)粒后LoVo細(xì)胞增殖率變化(MTT法)(±s，n=6)

表1 轉(zhuǎn)染PTTG siRNA質(zhì)粒后LoVo細(xì)胞增殖率變化(MTT法)(±s，n=6)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與HK組比較:2)P＜0.01;表2同

0.641±0.056 0.952±0.015 1.315±0.093 Lipo+HK組 0.612±0.0341) 0.813±0.0161) 1.287±0.091 Lipo+siRNA組 0.457±0.0771)2)0.549±0.0951)2)0.726±0.0181)2)24 h 48 h 72 h正常對(duì)照組組別

2.3 pGenesil PTTG siRNA質(zhì)粒對(duì)LoVo細(xì)胞周期和凋亡的影響 流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pGenesil－2.1－PTTG siRNA質(zhì)粒后LoVo細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分率均高于正常和陰性HK對(duì)照組(均P＜0.01)，而S期細(xì)胞百分率均低于正常和陰性HK對(duì)照組(均P＜0.01)，提示PTTG基因被干擾后可使LoVo細(xì)胞阻滯于 G0/G1期;Annexin V－PI雙染結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pGenesil－2.1－ PTTG siRNA質(zhì)粒后LoVo細(xì)胞凋亡百分率高于正常和陰性HK對(duì)照組(均P＜0.01)(表2)。

表2 pGenesil PTTG siRNA質(zhì)粒對(duì)LoVo細(xì)胞周期和凋亡的影響(±s，n=4)

表2 pGenesil PTTG siRNA質(zhì)粒對(duì)LoVo細(xì)胞周期和凋亡的影響(±s，n=4)

Apoptosis組別 G0/G1 S G2/M 49.66±4.14 47.69±4.37 2.66±1.88 13.56±3.82 Lipo+HK組 52.67±3.24 40.0±3.11 7.33±2.03 15.81±3.07 Lipo+siRNA3組60.97±4.381)2)35.58±5.971)2)3.55±2.16 50.29±1.281)2)正常對(duì)照組

3 討論

PTTG是一種強(qiáng)有力的腫瘤轉(zhuǎn)化基因，是一種細(xì)胞分裂后期的抑制因子，通過(guò)抑制分裂酶的活性抑制成熟前的染色體分裂。通過(guò)這一重要的功能，PTTG參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞周期的進(jìn)行、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡幾個(gè)關(guān)鍵的活動(dòng)〔7〕。PTTG在包括結(jié)腸癌等的大多數(shù)惡性腫瘤都有表達(dá)，且在正常組織中幾乎未見(jiàn)表達(dá)，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲進(jìn)程密切相關(guān)，故是結(jié)腸癌基因治療的理想靶點(diǎn)之一〔8〕。沉默PTTG基因可能抑制腫瘤細(xì)胞過(guò)度增生狀態(tài)，降低腫瘤的增殖活性，在整體上調(diào)解腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的同時(shí)也降低了某些癌基因的過(guò)度表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持這樣的推斷。pGenesil PTTG siRNA組，干擾質(zhì)粒表達(dá)出針對(duì)于PTTG mRNA的siRNA，對(duì)PTTG基因直接產(chǎn)生沉默效應(yīng)，該轉(zhuǎn)染組的PTTG蛋白的表達(dá)受到明顯的抑制，從客觀上證明了筆者構(gòu)建的干擾載體的有效性。

Pei〔9〕研究顯示 PTTG蛋白與 c－myc基因的接近轉(zhuǎn)錄起始位置的啟動(dòng)子序列結(jié)合，并激活其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。這與本研究相一致。筆者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pGenesil PTTG siRNA的LoVo細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組增殖速度降低。通過(guò)細(xì)胞周期分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pGenesil PTTG siRNA的LoVo細(xì)胞中，G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯增加，而S期細(xì)胞所占比例明顯減少。pGenesil PTTG siRNA轉(zhuǎn)染可能通過(guò)降低PTTG的表達(dá)，使在結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

Bernal等〔10〕使用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)篩選，證明在體內(nèi)或體外PTTG蛋白表達(dá)通過(guò)抑制p53基因的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)抑制p53基因在MCF－7細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡。在肺癌細(xì)胞系H1299，過(guò)度表達(dá)PTTG導(dǎo)致對(duì)p53凋亡誘導(dǎo)作用的抑制，并抑制p53的下游基因表達(dá)，如Bax、SFN和CDKN1A，提示PTTG抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，將PTTG基因沉默后結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡明顯增加，與對(duì)照組差異顯著，間接提示了PTTG與結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，但其與結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡是否與p53相關(guān)，且其機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。總之，針對(duì)PTTG的研究對(duì)明確結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制以及改善結(jié)腸癌的治療均有重要意義。針對(duì)PTTG的基因治療，可能為結(jié)腸癌的治療提供新的策略。

1 Magalh?es B，Peleteiro B，Lunet N.Dietary patterns and colorectal cancer:systematic review and meta－analysis〔J〕.Eur J Cancer Prev，2012;21(1):15－23.

2 Yuhara H，Steinmaus C，Cohen SE，et al.Is diabetes mellitus an independent risk factor for colon cancer and rectal cancer〔J〕?Am J Gastroenterol，2011;106(11):1911－21.

3 Nieuwenhuis MH，Lefevre JH，Bülow S，et al.Family history，surgery，and APC mutation are risk factors for desmoid tumors in familial adenomatous polyposis:an international cohort study〔J〕.Dis Colon Rectum，2011;54(10):1229－34.

4 Makino T，Shukla PJ，Rubino F，et al.The impact of obesity on perioperative outcomes after laparoscopic colorectal resection〔J〕.Ann Surg，2012;255(2):228－36.

5 McKay GD，Morgan MJ，Wong SK，et al.Improved short－term outcomes of laparoscopic versus open resection for colon and rectal cancer in an area health service:a multicenter study〔J〕.Dis Colon Rectum，2012;55(1):42－50.

6 Faiss S.The missed colorectal cancer problem〔J〕.Dig Dis，2011;29(Suppl 1):60－3.

7 Smith VE，F(xiàn)ranklyn JA，McCabe CJ.Pituitary tumor－transforming gene and its binding factor in endocrine cancer〔J〕.Expert Rev Mol Med，2010;12:e38.

8 Salehi F，Kovacs K，Scheithauer BW，et al.Pituitary tumor－transforming gene in endocrine and other neoplasms:a review and update〔J〕.Endocr Relat Cancer，2008;15(3):721－43.

9 Pei L.Identification of c－myc as a down－stream target for pituitary tumortransforming gene〔J〕.J Biol Chem，2001;276(11):8484－91.

10 Bernal JA，Hernández A.p53 stabilization can be uncoupled from its role in transcriptional activation by loss of PTTG1/securin〔J〕.J Biochem，2007;141(5):737－45.