王 蓓 王 曉 李建立 秦 英 邢邯英 (河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050051)

阿司匹林為非甾體類消炎藥，其藥理作用為抑制環(huán)氧化酶的活性，降低前列腺素的合成〔1，2〕。最近流行病學(xué)研究證實，阿司匹林及其他非甾體類消炎藥具有降低腫瘤發(fā)病率的作用，有文獻(xiàn)報道阿司匹林對腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用〔3〕，可以抑制食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤以及子宮內(nèi)膜癌的生長〔4〕。本研究觀察阿司匹林對體外培養(yǎng)的宮頸癌Hela細(xì)胞的形態(tài)及生長增殖狀況的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心);阿司匹林、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶DMSO等(Gibco公司);Giemsa染液、MTT(Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)和實驗分組 接種宮頸癌Hela細(xì)胞于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁生長約90%融合時，以0.25%胰酶消化，每周傳代2～3次。實驗分為對照組和阿司匹林干預(yù)組(阿司匹林純品溶于無水乙醇中，過濾除菌，再用RPMI-1640培養(yǎng)基分別配置成為不同濃度的溶液，無水乙醇最大濃度為1%)。

1.3 凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，以5×105/孔的密度接種于6孔板中，24 h后細(xì)胞貼壁良好，更換含有不同濃度0、1、5、10 mmol/L阿司匹林的RPMI-1640培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。小心取出蓋玻片并用PBS緩沖液沖洗兩遍，以固定液(冰醋酸∶甲醇=1∶3)固定30 min，用Haden磷酸緩沖液稀釋的Giemsa染液染色15 min，然后用清水沖洗多余染液，放置室溫風(fēng)干、樹脂封片、光學(xué)顯微鏡下觀察并攝像。

1.4 DNA提取及瓊脂糖電泳 收集經(jīng)過含不同濃度0、1、5 mmol/L阿司匹林培養(yǎng)基干預(yù)48 h的Hela細(xì)胞，將細(xì)胞分別加入1 ml細(xì)胞裂解液，震蕩混勻并加入50 μl 10%的SDS及蛋白酶K至終濃度100 mg/L，55℃水浴過夜，裂解細(xì)胞消化蛋白。冷卻后加等體積Tris Hcl飽和酚，充分震蕩后用低溫離心機(jī)，4℃ 4 000 r/min，離心15 min。小心吸取上層黏稠水相，移至另一離心管中，加等體積Tris Hcl飽和酚和氯仿=1∶1重復(fù)抽提，4℃ 4 000 r/min，離心15 min，小心吸取上清液，加等體積氯仿震蕩混勻，4℃ 4 000 r/min，離心15 min，小心吸取上清液，加3～5倍體積無水乙醇，放置－20℃，過夜沉淀DNA，取出后4℃4 000 r/min，離心 15 min，離心棄上清后，用 70% 乙醇 400 μl，4℃ 4 000 r/min，離心15 min，洗去殘留的有機(jī)物，室溫晾干。溶于200 μl無菌去離子水中溶解DNA，取4 μl DNA溶解產(chǎn)物與2 μl的溴酚藍(lán)混勻，加入1.5%的瓊脂糖凝膠加樣孔中，在80 V電壓下電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察DNA條帶。

1.5 細(xì)胞增殖抑制率檢測(MTT法) 常規(guī)培養(yǎng)Hela細(xì)胞，取進(jìn)入對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，經(jīng)PBS緩沖液沖洗兩遍并用胰酶消化后，用臺盼藍(lán)染液計數(shù)，檢測細(xì)胞活力大于95%后，用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)，制成1×104個/ml的細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔加入200 μl，細(xì)胞貼壁24 h后，更換含不同濃度0、1、5、10 mmol/L阿司匹林的RPMI-1640培養(yǎng)基，每個劑量6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，取出的培養(yǎng)板每孔加入噻唑藍(lán)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜(DMSO)150 μl，在搖床上震蕩20 min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇波長為492 nm于酶聯(lián)免疫吸附儀上測定各孔OD值。增殖細(xì)胞抑制率=(1－實驗組光度吸收值OD值/對照組光度吸收值OD值)×100%。細(xì)胞生長率=(實驗組光度吸收值OD值/對照組光度吸收值OD值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林作用Hela細(xì)胞后形態(tài)學(xué)變化 Giemsa染色后可見對照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞核染色均勻，核仁清晰可見;而阿司匹林組細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮、變圓，細(xì)胞核著色不均，核物質(zhì)邊集，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞Giemsa染色(×200)

2.2 阿司匹林作用Hela細(xì)胞后細(xì)胞基因組DNA變化 不同濃度阿司匹林作用Hela細(xì)胞48 h后，提取其細(xì)胞DNA，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的細(xì)胞DNA裂解帶，隨著作用濃度增加，DNA裂解明顯，而對照組則無此變化，說明阿司匹林可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。見圖2。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳的DNA Ladder帶

2.3 阿司匹林對Hela細(xì)胞增殖的影響 見圖3，阿司匹林干預(yù)組Hela細(xì)胞生長明顯出現(xiàn)抑制，與阿司匹林作用時間和作用濃度呈依賴性。5 mmol/L阿司匹林作用72 h后Hela細(xì)胞，增殖率為(70.31±4.96)%，10 mmol/L阿司匹林作用72 h后Hela細(xì)胞增殖率為(98.54±3.66)%，差異顯著(P＜0.05)，見圖3。對照組細(xì)胞生長正常。

圖3 各組細(xì)胞增殖曲線

3 討論

阿司匹林在臨床上應(yīng)用廣泛。近年來發(fā)現(xiàn)，長期服用小劑量阿司匹林可以預(yù)防冠心病、降低胃腸道腫瘤危險性，使其成為研究焦點(diǎn)。朱慧明等〔5〕報道阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞株HT229、SW620和肺癌SPCA-1細(xì)胞有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，在不同濃度范圍內(nèi)呈時間-濃度依賴性關(guān)系〔6〕。一定濃度阿司匹林作用宮頸癌Hela細(xì)胞24 h后，即可明顯改變細(xì)胞周期時相分布將細(xì)胞阻滯于DNA合成期，阻止DNA合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;阿司匹林對Hela細(xì)胞抑制作用以誘導(dǎo)凋亡為主，而且藥物對細(xì)胞的損傷、細(xì)胞周期時相分布的影響和誘導(dǎo)凋亡作用三者均有時間-濃度依賴性，且均呈正相關(guān)。本文結(jié)果提示阿司匹林作用于Hela細(xì)胞在細(xì)胞進(jìn)入DNA合成后期可引起DNA損傷，使細(xì)胞停滯在G2/M期。與劉興等研究阿司匹林對胃癌細(xì)胞株SGC-7901在G0/G1期減少，S期和G2/M期細(xì)胞增多結(jié)果相似，而朱慧明等〔5〕發(fā)現(xiàn)阿司匹林使人肺腺癌細(xì)胞株SPCA-1在G0/G1期增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少。

阿司匹林抑制腫瘤生長的機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為主要機(jī)制為阿司匹林抑制COX-2酶發(fā)揮作用〔7〕，COX-2酶能夠在上皮細(xì)胞中過度表達(dá)，抑制凋亡發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤〔8〕;另外阿司匹林可以影響B(tài)cl-2基因家族的調(diào)控，可以上調(diào)促進(jìn)凋亡的bax、bak基因和下調(diào)抑制凋亡bcl-2基因的作用〔9〕;還可以激活誘發(fā)凋亡最關(guān)鍵的信號分子半胱氨酸蛋白血酶的caspase家族〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林處理宮頸癌Hela細(xì)胞后，可以影響B(tài)cl-2基因家族的調(diào)控，上調(diào)促進(jìn)凋亡的Bax基因表達(dá)同時下調(diào)抑制凋亡Bcl-2基因引起細(xì)胞凋亡;此可能為阿司匹林抑制Hela細(xì)胞增殖的主要機(jī)制。

綜上所述，阿司匹林在體外可抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖〔11〕，其機(jī)制可能為抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，改變其細(xì)胞周期時相分布有關(guān)〔12〕。

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