鄒 琦 鄭祥雄 (福建醫(yī)科大學(xué)協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科，福建 福州 350001)

糖尿病腎病是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，是以早期發(fā)生蛋白尿，隨后逐漸出現(xiàn)腎小球?yàn)V過(guò)率下降，并伴有腎小球硬化為特征。腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能障礙可導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。然而目前對(duì)于糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。越來(lái)越多的證據(jù)表明足細(xì)胞對(duì)于腎小球?yàn)V過(guò)屏障選擇滲透性的改變起到重要的作用，隨著對(duì)足細(xì)胞研究的深入，也逐漸認(rèn)識(shí)到足細(xì)胞在糖尿病腎病發(fā)病中的重要作用。本研究通過(guò)建立糖尿病腎病模型，觀察低劑量雷帕霉素對(duì)大鼠腎臟病理改變，以及足細(xì)胞特異的蛋白分子nephrin表達(dá)的影響，探討低劑量雷帕霉素能否通過(guò)維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整而發(fā)揮對(duì)早期糖尿病腎病的腎臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇清潔級(jí)健康雄性SD大鼠(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供)，體重200～250 g，生長(zhǎng)良好，大鼠放置在通風(fēng)良好，18～22℃恒溫環(huán)境中分籠飼養(yǎng)(每籠3只)，提供12 h交替照明，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲用水。將大鼠分為正常對(duì)照組(C組，n=7)，糖尿病組(D組，n=7)，雷帕霉素治療組(R組，n=8)。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠 nephrin(SANTA CRUZ，美國(guó))，通用型二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，TRIZON(Invitrogen，美國(guó))，cDNA第一鏈合成試劑盒kit1(Fermentas，立陶宛)。

1.3 動(dòng)物模型建立 大鼠禁食12 h后，予1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液按75 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射。STZ注射72 h后，尾靜脈取血測(cè)血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。造模后第7、14、28天再次測(cè)血糖，仍符合上述標(biāo)準(zhǔn)者為穩(wěn)定成模的大鼠，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，不符合者退出實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 第5周起R組大鼠按1 mg/kg體重給予0.3%雷帕霉素溶液每日灌胃給藥，C組和D組以相同體積0.5%羧甲基纖維素溶液灌胃，共干預(yù)8 w。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)期間均喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，不使用胰島素。各組大鼠喂養(yǎng)至12 w，處死前1 d將大鼠放入代謝籠中，禁食不禁水，以免食物殘?jiān)廴灸蛞?。收集大?4 h尿液。心臟穿刺抽血3 ml離心后取血清用于生化指標(biāo)檢測(cè);處死后取部分腎皮質(zhì)在冰面上切修成1 mm的薄片置于3%戊二醛中，4℃固定，用于透射電鏡檢查;部分腎組織置于4%多聚甲醛固定24 h，用于免疫組化檢查;其余腎組織置于干燥EP管中，置入液氮中保存，用于RT-PCR檢測(cè)。

1.4.1 觀察指標(biāo) 采用BCA法檢測(cè)24 h尿蛋白，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖、血肌酐、尿肌酐，并通過(guò)公式計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。Ccr(ml/min)=尿肌酐(mmol/L)×尿量(ml)/血肌酐(mmol/L)×1 440，體重校正的 Ccr〔ml·min－1·100 kg－1〕=Ccr/BW(g)×100，通過(guò)透射電鏡檢查足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4.2 免疫組化檢測(cè) 石蠟包埋切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15 min，PBS沖洗3次，加血清封閉非特異抗體，予一抗(兔抗大鼠 nephrin 1∶100)4℃過(guò)夜孵育，滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體，37℃孵育30 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。顯微鏡觀察并攝片。nephrin蛋白表達(dá)采用半定量分析，在高倍鏡下(400×)每張切片按順時(shí)針?lè)较蜓啬I皮質(zhì)隨機(jī)選取10個(gè)腎小球，分別攝片。應(yīng)用圖像軟件分析系統(tǒng)(Image-Pro-Plus6.0)分別計(jì)算每個(gè)腎小球上nephrin表達(dá)的整合光密度(IOD)及相應(yīng)的腎小球面積，兩者比值即為每個(gè)腎小球nephrin表達(dá)的腎小球陽(yáng)性指數(shù)，取10個(gè)腎小球該比值的均數(shù)，即為每張切片nephrin陽(yáng)性表達(dá)的腎小球指數(shù)。腎小球陽(yáng)性指數(shù)=腎小球內(nèi)各指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)整合光密度/相應(yīng)腎小球面積。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè) 取液氮中凍存的腎皮質(zhì)約100 mg，在陶瓷研缽中研磨成粉末，用Trizol試劑標(biāo)準(zhǔn)程序提取腎皮質(zhì)總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)的A值，計(jì)算RNA濃度。取2 μg RNA按cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1 μl模板cDNA，用nephrin、β-actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海生工合成。1)nephrin:上游引物:5`-CGTCAGCATCAGCAGCAACC-3`，下游引物:5`-AGCCACATCTTCCAGCCTCTC-3`，擴(kuò)增產(chǎn)物 72 bp;2)β-actin:上游引物:5'TGTTGTCCCTGTATGCCTCTG 3'，下游引物:5'ACCGCTCATTGCCGATAGTG 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物348 bp。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃終末延伸5 min，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性條帶吸光度積分掃描并記錄。用β-actin作為內(nèi)參照校正，用目的基因的吸光度與β-actin的吸光度的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)量資料用±s表示，方差齊者組間比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 觀察指標(biāo) 12 w末，D組大鼠血糖、體重校正的Ccr、24 h尿蛋白與C組比較明顯增多(P＜0.01)，R組大鼠體重校正的Ccr、24 h尿蛋白與D組比較明顯減少(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 12 w末各組大鼠血糖、體重校正的Ccr、24 h尿蛋白比較(±s)

表1 12 w末各組大鼠血糖、體重校正的Ccr、24 h尿蛋白比較(±s)

與C組比較:1)P＜0.01，與D組比較:2)P＜0.01

組別 n 血糖(mmol/L)體重校正的Ccr(ml·min －1·100 kg-1)24 h尿蛋白(mg/24 h)7 6.41±1.06 0.49±0.05 6.79±0.50 D組 7 30.63±0.981) 0.87±0.111) 98.81±3.601)R組 8 29.54±1.101) 0.68±0.142) 51.58±2.111)2)C組

2.2 腎組織超微結(jié)構(gòu)檢查 透射電鏡下觀察，C組足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，足突形態(tài)細(xì)長(zhǎng)、規(guī)則，排列整齊，基底膜無(wú)明顯增厚;D組見(jiàn)基底膜節(jié)段性增厚，足突排列不齊，可見(jiàn)足突增寬、融合，部分可見(jiàn)足突消失。R組上述改變較DN組減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 電鏡下足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖

2.3 腎組織免疫組化半定量分析 12 w末，D組大鼠nephrin蛋白表達(dá)較C組明顯減少(0.018 3±0.001 2 vs 0.081 1±0.004 1，P＜0.01)。R組大鼠nephrin蛋白表達(dá)與D組相比明顯增多(0.026 3±0.001 5，P ＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 12 w末各組大鼠腎小球nephrin的表達(dá)

2.4 RT-PCR檢測(cè) 12 w末，D組大鼠nephrin mRNA表達(dá)水平較C組明顯減少(0.342 2±0.025 2 vs 0.636 7±0.017 4，P＜0.01)。R組大鼠 nephrin mRNA表達(dá)水平較D組增多(0.432 3±0.019 7，P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠腎小球nephrin mRNA的表達(dá)

3 討論

蛋白尿是糖尿病腎病的重要臨床表現(xiàn)。長(zhǎng)期蛋白尿是慢性腎臟疾病腎功能損傷進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。減少尿蛋白排泄可延緩腎病的進(jìn)展〔1，2〕。腎小球?yàn)V過(guò)屏障是由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜、足細(xì)胞構(gòu)成的。足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，是一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)及功能的細(xì)胞。足細(xì)胞的足突通過(guò)-α3β1整合素和肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖黏附于腎小球基底膜(GBM)上〔3〕。相鄰足細(xì)胞的足突之間相互交錯(cuò)形成直徑為30～40 nm的裂孔，孔上覆蓋一層厚4～6 nm的裂孔隔膜(SD)，水和小分子物質(zhì)可以自由通過(guò)裂孔隔膜，但大分子的血漿蛋白不能通過(guò)。因此，足細(xì)胞與足突之間的裂孔隔膜成為阻止蛋白通過(guò)的最終屏障。當(dāng)足細(xì)胞受損時(shí)，足突的正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，濾過(guò)膜完整性受到破壞，導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生。

nephrin，CD2AP，podocin等多種蛋白質(zhì)分子組成SD復(fù)合物，其中一些蛋白質(zhì)分子在維持SD復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能完整性方面發(fā)揮重要的作用。NPHS1的蛋白產(chǎn)物nephrin，僅在腎臟足細(xì)胞中表達(dá)〔4〕，nephrin與podocin相互作用，通過(guò)CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)結(jié)合在細(xì)胞骨架上。Putaala等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，NPHS1失活的大鼠出現(xiàn)蛋白尿及部分足突消失;同樣，Orikasa等〔6，7〕研究也發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠注射抗nephrin抗體也可導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。通過(guò)對(duì)微小病變腎病及嘌啉霉素腎病模型的研究發(fā)現(xiàn)nephrin mRNA低表達(dá)與蛋白尿發(fā)生呈負(fù)相關(guān)〔8，9〕nephrin與蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)，可推測(cè)nephrin對(duì)于維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的功能起重要作用。有研究證實(shí)糖尿病腎病中由于高血糖、糖化血紅蛋白及血管緊張素Ⅱ增多使nephrin表達(dá)下調(diào)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病腎病組大鼠24 h尿蛋白排泄較對(duì)照組明顯增多，電鏡觀察提示糖尿病組大鼠出現(xiàn)足突增寬、融合，部分可見(jiàn)足突消失，免疫組化及RT-PCR半定量分析提示nephrin蛋白及mRNA表達(dá)均較對(duì)照組明顯減少。因此，由于糖尿病腎病時(shí)循環(huán)中的血糖、AGE、ANGⅡ、ROS、TGF-β等因素的增加均可誘發(fā)nephrin的表達(dá)下調(diào)，引起裂孔隔膜分子結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致足突形態(tài)變化，出現(xiàn)足突增寬、融合，使血漿蛋白通過(guò)的最終屏障被破壞，血漿蛋白漏出，產(chǎn)生蛋白尿，從而促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)展。

雷帕霉素臨床上作為免疫抑制藥用于腎移植患者抗排斥反應(yīng)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素對(duì)某些慢性腎臟疾病可能具有治療的潛力。Torras等〔11〕通過(guò)建立兩種不同發(fā)病機(jī)制的腎病模型，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對(duì)于兩種腎病模型在腎臟損傷、蛋白尿排泄及足細(xì)胞損傷的影響具有兩種相反的作用，其可減輕慢性腎臟疾病的蛋白尿，并使nephrin的表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)可推測(cè)低劑量雷帕霉素可通過(guò)緩解高血糖等因素造成的足細(xì)胞損傷，維持裂孔隔膜結(jié)構(gòu)完整而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

蛋白尿的出現(xiàn)可加重糖尿病腎病的腎臟損害。近年來(lái)，越來(lái)越多證據(jù)表明足細(xì)胞對(duì)于糖尿病腎病早期腎臟結(jié)構(gòu)和功能改變起重要作用。其中足突間的SD的完整性是使腎小球?yàn)V過(guò)屏障具有高度滲透選擇性的重要因素之一，SD損傷直接導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。近年研究表明低劑量雷帕霉素可減輕蛋白尿的發(fā)生，對(duì)于慢性腎損傷，低劑量雷帕霉素可通過(guò)增加nephrin及podocin的表達(dá)，維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障及足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，使蛋白尿排出減少，從而延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。

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