段現(xiàn)花 王德廣 歐陽長杰 曲德偉 (徐州醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，江蘇 徐州 221002)

羊膜上皮細(xì)胞(AECs)起源于胚胎發(fā)育時期的胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)〔1，2〕，是將來發(fā)育形成胎兒的部分。人受精8 d內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化成上胚層和下胚層，AECs源于上胚層〔3〕，也有研究表明胚胎干細(xì)胞源于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)〔4〕。研究證實，大鼠AECs有趨向上胚層、中胚層和下胚層細(xì)胞分化的潛能〔5，6〕，因此大鼠 AECs作為再生醫(yī)學(xué)細(xì)胞資源參與疾病治療已受到廣泛關(guān)注〔7〕。本研究通過免疫組化和流式細(xì)胞儀技術(shù)對分離、培養(yǎng)的羊膜干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為細(xì)胞移植治療脊髓損傷提供優(yōu)良的種子細(xì)胞〔8〕。

1 材料與方法

1.1 材料 無特殊病原體(SPF)孕14～16 d的SD大鼠，由徐州醫(yī)學(xué)院動物中心提供。無菌采集羊膜標(biāo)本。實驗中對動物的操作嚴(yán)格參照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物指導(dǎo)性意見》中有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。DMEM/F-12(Gbibo公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，0.25%胰蛋白酶、小鼠nestin抗體、小鼠 β-Ⅲ-tublin抗體、小鼠膠原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體、山羊抗小鼠IgG和青霉素-鏈霉素溶液(PS)(碧云天公司)，CD29和CD44抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 AECs的分離與培養(yǎng) 采用機(jī)械法剝離胎盤羊膜組織，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)漂洗，除盡表面血跡，于含有適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中剪碎羊膜至1 mm3左右，轉(zhuǎn)移組織懸液于50 ml離心管中，加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃均勻消化15 min，用含有10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化，400目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞懸液于離心管中，1 200 r/min離心5 min，加入含有10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用臺盤藍(lán)計數(shù)細(xì)胞密度，以1×106的細(xì)胞密度接種于25 ml的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1次/3 d換液，1 w后待細(xì)胞長滿瓶底的90%時進(jìn)行傳代，取第2～3代的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞分析。

1.3 大鼠AECs的鑒定

1.3.1 免疫熒光細(xì)胞化學(xué) 多聚賴氨酸包被爬片的12孔板，取2～3代的rAECs用0.25%胰酶消化、傳代，然后接種，細(xì)胞達(dá)到70%融合時，吸除培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱PBS漂洗3次，預(yù)冷4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次，5 min/次，用0.3%Triton-X100室溫下孵育15 min，PBS漂洗3次，用含有10%FBS的PBS室溫下封閉40 min。吸出后直接加入nestin、β-Ⅲ-tublin或 GFAP抗體，37℃孵育30 min后移入4℃冰箱過夜，次日用PBS漂洗3次，避光條件下加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次，然后用hochest33258孵育15 min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。陰性對照組用PBS代替一抗。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原 用0.25%胰酶消化收集2～3代rAECs于50 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min，吸除上清，用適量的PBS漂洗細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml分裝于3個10 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min，吸除上清，每管加入100 μl PBS重懸細(xì)胞，避光條件下加入熒光標(biāo)記單抗CD29-FITC和 CD44-PE 各 20 μl，對照組加入等量 PBS，混勻，37℃避光孵育30 min后1 200 r/min離心5 min，吸除上清后用PBS漂洗細(xì)胞2次并離心，每管加入200～400 μl PBS，混勻，移入流式管中，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠AECs的生長及增殖特點 原代培養(yǎng)1 d后，有少量細(xì)胞貼壁;第3天以后，貼壁細(xì)胞逐漸增多，形態(tài)多為扁平不規(guī)則的多角形或梭形，胞體大，胞核呈分裂相。培養(yǎng)1 w后，細(xì)胞貼壁牢靠，生長較為旺盛，細(xì)胞呈鋪路石樣緊密排列，匯合度達(dá)90%以上時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞較原代易于貼壁，增殖速度加快。六代以后的細(xì)胞增殖逐漸減慢，胞體變大呈扁平樣。見圖1。

圖1 培養(yǎng)3 d原代AECs

2.2 大鼠羊膜上皮細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)特征 免疫熒光檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞不同程度的表達(dá)nestin，但不表達(dá)β-Ⅲ-tublin和GFAP。見圖2。

圖2 大鼠羊膜上皮細(xì)胞的免疫熒光染色

2.3 細(xì)胞表面抗原檢測結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，AECs高表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白 CD29達(dá)到94.31%，CD44高達(dá)99.98%。

3 討論

目前的研究證實，大鼠AECs表達(dá)胚胎干細(xì)胞的部分多能性表面抗原以及細(xì)胞內(nèi)分子標(biāo)志。在體外經(jīng)過特定條件誘導(dǎo)下能向三個胚層細(xì)胞類型分化〔4，9〕，其中向神經(jīng)外胚層細(xì)胞方向分化的研究比較多〔10〕。此外，由于AECs組織來源豐富，較少引起醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭議，已成為了一種有潛力的再生醫(yī)學(xué)干細(xì)胞來源。

巢蛋白nestin是普遍用來鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)前體細(xì)胞的蛋白〔5，11〕，但也有相關(guān)報道巢蛋白在大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞和人肝干細(xì)胞中表達(dá)〔12〕。β-Ⅲ-tublin是在神經(jīng)元分化過程中檢測到的蛋白，表達(dá)于未成熟神經(jīng)元中〔5〕。GFAP是在成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞中特異表達(dá)的蛋白〔8〕。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果表明AECs表達(dá)nestin，具備干細(xì)胞特性。β-Ⅲ-tublin和GFAP的陰性表達(dá)說明羊膜干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中沒有向神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。但是提取大鼠定向誘導(dǎo)的AECs總RNA〔13〕，其中有β-Ⅲ-tublin以及GFAP的基因表達(dá)，這說明AECs可定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的潛能。研究表明AECs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD29和CD44〔9〕，但是不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34，本實驗結(jié)果與之一致。

依此看來，AECs可以作為干細(xì)胞資源參與再生醫(yī)學(xué)的研究，并有望參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床治療。之前已有關(guān)于AECs治療脊髓損傷的研究報道〔14〕，但其治療效果并不理想。目前基因修飾的細(xì)胞移植治療脊髓損傷越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。olig-2是一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子，對于少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生及其形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘發(fā)揮重要作用〔15〕。有研究報道轉(zhuǎn)染olig-2的神經(jīng)干細(xì)胞能有效改善脊髓損傷后的髓鞘形成〔16〕。基于大鼠AECs的分離培養(yǎng)及鑒定已經(jīng)成熟，而且具有優(yōu)越的干細(xì)胞特性，因此接下來將進(jìn)行olig-2基因修飾AECs的研究，為脊髓損傷的細(xì)胞移植治療奠定基礎(chǔ)。

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