劉偉峰 于曉暉 劉正湘 左后娟 (淄博市中心醫(yī)院心內(nèi)科，山東 淄博 55036)

四跨膜超家族蛋白(TM4SF)是細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)分子進(jìn)化過程中序列高度保守的一類蛋白族群，亦是整合素的關(guān)聯(lián)蛋白〔1〕，其中CD151是TM4SF最重要的成員之一。我們過去的研究均證實CD151能促進(jìn)血管新生〔2～4〕，但目前其作用的分子機(jī)制仍不清楚，Rac1和Cdc42信號分子與血管新生過程關(guān)系密切，在本研究中，我們通過重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)將CD151基因轉(zhuǎn)染至大鼠后肢肌肉組織中，然后建立后肢缺血模型，通過觀察CD151基因表達(dá)情況以及對Rac1和Cdc42信號通路的影響來進(jìn)一步揭示CD151促血管新生的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 pZeoSV-CD151由美國Tennessee大學(xué)惠贈。p-AAV-GFP由美國北卡羅萊那州立大學(xué)基因治療中心饋贈。大腸桿菌E.coliDH5α菌株(Invitrogen公司)。質(zhì)粒p-AAV-CD151由本課題組前期構(gòu)建。羊抗人CD151抗體(Santa Cruz公司)、PVDF膜(Life Science公司)。化學(xué)發(fā)光試劑ECL(Pirce公司)。β-actin抗體(Santa Cruz公司)，Rac1、Cdc42和 phospho-Rac1/cdc42(Cell Signaling Technology公司)。按照三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法在人胚腎上皮細(xì)胞系(293細(xì)胞)包裝和復(fù)制生成rAAV-CD151和rAAV-GFP病毒，并用實時PCR法測定病毒滴度。

1.2 大鼠后肢局部轉(zhuǎn)染重組腺相關(guān)病毒 成年Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血對照(生理鹽水)組、GFP組和CD151組，分別經(jīng)肌肉多點注射生理鹽水，rAAV-GFP和rAAV-CD151(1.5×l011pfu/只)，假手術(shù)組和缺血對照組僅注射相同體積的生理鹽水。注射位點分別為:股內(nèi)收肌(3點)、股四頭肌(3點)、半膜肌(2點)，腓腸肌(2點)，每個注射位點100 μl。基因轉(zhuǎn)染1 w后制備大鼠后肢缺血模型。

1.3 大鼠后肢缺血模型的建立 2%戊巴比妥鈉(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。行大鼠左后肢縱行切口從腹股溝韌帶向下延伸至膝關(guān)節(jié)。在股動脈起始部和遠(yuǎn)端隱動脈與腿彎動脈分叉之間游離股動脈，結(jié)扎所有游離段股動脈分支，切除股動脈，建立大鼠后肢缺血模型，假手術(shù)組施行相同的手術(shù)步驟，但不切除股動脈。

1.4 Western印跡檢測局部肌肉組織CD151、Rac1和Cdc42的表達(dá) 術(shù)后5 w檢測四組樣品的CD151蛋白表達(dá)情況，以βactin為內(nèi)參照。分別提取四組大鼠缺血后肢肌肉組織蛋白。取含等量蛋白質(zhì)的裂解液加等體積2×加樣緩沖液(不含2-巰基乙醇)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后25 V、4℃條件下過夜將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，37℃ 1%脫脂奶粉封閉2.5 h后分別與相應(yīng)抗體4℃孵育過夜，1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。最后經(jīng)ECL顯色檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CD151蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測 各組動物肌肉組織均出現(xiàn)特異性條帶，假手術(shù)組、缺血對照組、GFP組條帶較窄且顏色較淺，CD151組呈現(xiàn)寬且顏色深的條帶(圖1)，結(jié)果顯示CD151蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加〔(410.7±18.6)%〕，與缺血對照組、GFP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔(201.3±16.7)%vs(209.6±19.4)%，P＜0.05〕，缺血對照組、GFP組比較表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，假手術(shù)組CD151蛋白質(zhì)表達(dá)最少(100%)。說明CD151基因的導(dǎo)入明顯增加CD151蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2.2 CD151基因轉(zhuǎn)染對Rac1和Cdc42信號通路的影響Western印跡免疫印跡檢測p-Rac1/Cdc42、Rac1/2/3和Cdc42，p-Rac1/Cdc42分別用Rac1/2/3和Cdc42進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，p-Ccdc42表達(dá)量 CD151組(503.6±20.1)%、缺血對照組(137.3±13.4)%、GFP組(144.6±12.7)%、假手術(shù)組為100%;p-Rac1表達(dá)量為CD151組(547.6±23.4)%、缺血對照組(140.6±12.4%)、GFP組為(147.2±13.2)%、假手術(shù)組為100%;結(jié)果顯示CD151組p-Rac1/Cdc42蛋白表達(dá)明顯高于其余三組(P＜0.01)，表明CD151蛋白表達(dá)的增加激活Rac1和Cdc42信號通路(圖2)。

圖1 Western印跡檢測大鼠缺血后肢CD151蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡檢測大鼠缺血后肢p-Rac1/Cdc42、總Rac和總Cdc42的蛋白表達(dá)

3 討論

血管新生是體內(nèi)重要的病理生理過程，在腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤以及缺血性疾病的血運(yùn)重建等病理生理過程中發(fā)揮著十分重要的作用，它是指內(nèi)皮細(xì)胞通過增殖和分化在原有血管基礎(chǔ)上以芽生或非芽生的形式生成血管〔5〕。

CD151能夠促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)的形成〔2〕，且能夠促進(jìn)缺血組織的血管形成并在一定程度上改善這些缺血組織器官的功能〔3，4〕。但CD151促血管新生的分子機(jī)制仍不明確，在進(jìn)一步的研究中我們發(fā)現(xiàn)CD151蛋白表達(dá)可以激活缺血組織的MAPKs和PI3K/Akt信號通路，上述信號分子被認(rèn)為參與了血管新生過程〔3，4〕，但是除此之外CD151是否還激活了其他的與血管新生有關(guān)的信號通路，Rac1和Cdc42信號分子與血管新生過程關(guān)系密切，內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel模型中形成毛細(xì)血管管腔結(jié)構(gòu)的過程中Rac1和Cdc42發(fā)揮了重要作用〔6〕，研究發(fā)現(xiàn)CD151基因缺失小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞的趨化遷移，伸展和侵襲能力減弱，同時該細(xì)胞的Rac1和Cdc42活性明顯減弱〔7〕，表明Rac1和Cdc42參與了小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞的趨化遷移和伸展等過程。

本研究顯示將CD151基因轉(zhuǎn)染至大鼠后肢肌肉組織內(nèi)，6 w后CD151蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加，表明外源性CD151基因能夠在大鼠缺血肌肉組織中有效表達(dá)，同時表明CD151可以激活Rac1和Cdc42信號通路，進(jìn)而促進(jìn)缺血下肢的血管新生，改善缺血肢體的功能。本實驗進(jìn)一步豐富了CD151促血管新生的分子機(jī)制。

1 Hemler M.Tetraspanin functions and associated microdomains〔J〕.NatRev Mol Cell Biol，2005;6(10):801-11.

2 Zheng Z，Liu Z.CD151 gene delivery increases eNOS activity and induces ECV304 migration，proliferation and tube formation〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2007;28(1):66-72.

3 Zuo H，Liu Z，Liu X，et al.CD151 gene delivery after myocardial infarction promotes functional neovascularization and activates FAK signaling〔J〕.Mol Med，2009;15(9-10):307-15.

4 Zheng Z＇Liu Z.CD151 gene delivery activates PI3K/Akt pathway and promotes neovascularization after myocardial infarction in rats〔J〕.Mol Med，2006;12(9-10):214-20.

5 Dvorak H.Angiogenesis:update 2005〔J〕.J Thromb Haemost，2005;3(8):1835-42.

6 Bayless K，Davis G.The Cdc42 and Rac1 GTPases are required for capillary lumen formation in three-dimensional extracellular matrices〔J〕.J Cell Sci，2002;115(6):1123-36.

7 Takeda Y，Kazarov A，Butterfield C，et al.Deletion of tetraspanin Cd151 results in decreased pathologic angiogenesis in vivo and in vitro〔J〕.Blood，2007;109(4):1524-32.