江雪萍 徐艷萍 楊忠偉 肖 白 馮秀麗 (新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)七師醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 奎屯 833200)

冠心病是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜疾病，發(fā)病過(guò)程與多基因之間和基因-環(huán)境之間的相互作用等有關(guān)，可能存在多個(gè)與冠心病相關(guān)的基因，這些基因單個(gè)起作用或聯(lián)合作用，還可能與傳統(tǒng)易感因素共同作用而增加冠心病的危險(xiǎn)性。我們應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)檢測(cè)了新疆82例漢族正常個(gè)體和42例冠心病患者eNOS基因G894T突變的情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)抽取124例新疆地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系的漢族正常人群和漢族冠心病患者的靜脈血各3 ml，EDTA.K2抗凝，充分混勻后放入－20℃冰箱冷藏室保存待檢。漢族正常人群經(jīng)檢查已排除冠心病、高血壓、糖尿病及腦血管病。82例中男47例，女35例，年齡18～62歲;漢族冠心病人42例，其中男31例，女11例，年齡30～79歲。漢族冠心病人均符合1979年WHO冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)且心電圖檢查均為陳舊性心肌梗死患者。

1.2 主要儀器 Master cycler Reppendorf PCR儀(梯度核酸擴(kuò)增儀)，購(gòu)自上海艾本德生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易有限公司;2.5%瓊脂糖凝膠電泳EB染色、上海生物工程有限公司試劑盒。UVP AC暗箱+GEL相機(jī)凝膠成像儀，購(gòu)自天美有限公司。

1.3 DNA的提取 常規(guī)酚抽提法提取基因組DNA。BioRad紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度并標(biāo)化至100 ng/μl。

1.4 多聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)eNOS基因G894T多態(tài)性 ①引物設(shè)計(jì)與合成參照文獻(xiàn)〔1〕設(shè)計(jì)引物:上游引物5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3';下游引物:5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3';② PCR擴(kuò)增:反應(yīng)體系為25 μl，包括 DNA模板 1.0 μl、10 × 緩沖液 (Mg2+)2.5 μl，dNTP Mix 2.0 μl，正義鏈引物 0.2 μl，反義鏈引物 0.2 μl Taq 酶 0.2 μl，純凈水 18.9 μl;③PCR儀擴(kuò)增反應(yīng)條件:預(yù)變性為95℃ 2 min，變性95℃ 30 s，退火66℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共37個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物為248 bp，經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，100 V，30 min，置凝膠成像儀上觀察特異性條帶，打印并記錄了實(shí)驗(yàn)結(jié)果;④基因型檢測(cè):限制性酶切反應(yīng)體系10 μl，包括 PCR 產(chǎn)物 8.4 μl、10 × 緩沖液 1 μl、BaⅡ內(nèi)切酶(大連寶提供)0.6 μl，37℃酶切2 h終止。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像，觀察基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)算新疆漢族正常人群和冠心病患者兩組基因型頻率和等位基因頻率，經(jīng)過(guò)Hardy Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，表明各基因型頻率已達(dá)遺傳平衡，具有群體代表性。各組間頻率比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 電泳結(jié)果 G等位基因存在BanⅡ酶切位點(diǎn)，而T等位基因沒(méi)有BanⅡ酶切位點(diǎn)。因此GG基因型酶切產(chǎn)物為163和85 bp，GT基因型具有248和163 bp，TT基因型酶切產(chǎn)物為248 bp，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 漢族正常人群PCR產(chǎn)物及經(jīng)BanⅡ酶切后瓊脂糖凝膠電泳

圖2 漢族冠心病人PCR產(chǎn)物及經(jīng)BanⅡ酶切后瓊脂糖凝膠電泳

2.2 新疆漢族正常人群eNOS基因頻率 在82例樣品中，GG型69例，GT型10例，TT型3例，三種基因型的頻率分別為0.84、0.12、0.04，G 和 T 等位基因分布頻率分別為 0.90、0.10。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，這些比例與 Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.166 4，P＞0.05)，具有群體代表性。等位基因頻率分布男女間無(wú)顯著性差異(χ2=0.004 1，P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 新疆漢族正常人群eNOS基因型及等位基因頻率分布

2.3 新疆漢族冠心病人eNOS基因頻率 在42例樣品中，GG型32例，GT型6例，TT型4例，三種基因型的頻率分別為0.76、0.14、0.10，G 和 T 等位基因的頻率分別為 0.83、0.17。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，這些比例與 Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.305 7，P＞0.05)，具有群體代表性。等位基因頻率分布男女間無(wú)顯著性差異(χ2=0.024 6，P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 新疆漢族冠心病人eNOS基因型及等位基因頻率分布

2.4 新疆漢族82例正常人群與42例冠心病人eNOS基因G894T多態(tài)性GG、GT、TT及G和T等位基因分布頻率比較，新疆漢族冠心病人eNOS基因G894T多態(tài)性有GG基因型頻率下降，TT基因型頻率升高趨勢(shì)，但與漢族正常人相比差異不顯著(χ2=1.532 8，P＞0.05)。而G和T等位基因頻率分布也有上述趨勢(shì)，但差異不顯著(χ2=0.682 1，P＞0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

eNOS是左旋精氨酸一氧化氮途徑的關(guān)鍵酶，eNOS催化生成的NO具有舒張血管、調(diào)節(jié)血流、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和清除超氧自由基、抑制血小板聚集、黏附和白細(xì)胞的趨化激活等重要功能，是心血管系統(tǒng)抗動(dòng)脈粥樣硬化、防止血栓形成和維持正常血管舒縮反應(yīng)中必不可少的保護(hù)因子〔2〕。有研究發(fā)現(xiàn)eNOS基因第7外顯子中的G894T突變和冠心病的發(fā)病及心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)〔3，4〕。Colombo 等〔5〕的研究顯示G894T錯(cuò)義突變與意大利人冠心病的存在和嚴(yán)重程度相關(guān)。eNOS基因分布不同，存在種族差異〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)新疆漢族冠心病人中存在eNOS基因G894T多態(tài)性GG基因型頻率下降，TT基因型頻率升高趨勢(shì)，G和T等位基因頻率分布也有上述趨勢(shì)，但與漢族正常人差異不顯著，可能與年齡差異以及樣本量小有關(guān)，目前還不能完全排除新疆漢族冠心病的發(fā)生與eNOS基因G894T突變的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

1 Adam V，Benjafield D，Brain J.Morris association analysis of endothelial nitric oxide synthase gene in essential hypertension J〔J〕.Am J Hypertension，2000;13:994-8.

2 Lefer AM.Nitric oxide nature's naturally occurring leukocyte inhibitor〔J〕.Circulation，1997;95(3):553-4.

3 Lee WH，Hwang TH，Oh GT，et al.Genetic factors associated with endothelial dysfunction affect the early onset of coronary artery disease in Korean males〔J〕.Vasc Med，2001;6:103-8.

4 唐歐杉，徐 耕，秦豐明，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)性和早發(fā)冠心病的相關(guān)性研究〔J〕.嶺南心血管病雜志，2004;10:293-6.

5 Colombo MG，Andreassi MG，Paradossi U，et al.Evidence for association of a common variant of the endothelial nitric oxide synthase gene(Glu298 Asp polymorphism)to the presence extent and severity of coronary artery disease〔J〕.Heart，2002;87(6):525-8.

6 Miyamoto Y，Saito Y，Kajiyama N，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension〔J〕.Hypertension，1998;32:38.