朱曼麗 焦 誼 龍 梅 毛新民 馬曉麗 古扎麗努爾·艾爾肯 武 云 王 燁 李琳琳

(新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

隨著高脂肪、低碳水化合物飲食日益增多，體力活動強度和勞動強度的普遍下降，我國人群超重和肥胖率呈明顯增加趨勢〔1〕。在新疆地區(qū)由于特殊的地理環(huán)境和少數(shù)民族獨特的生活方式使得維吾爾族人群肥胖的流行狀況和特征存在與其他民族不同之處，研究顯示維吾爾族男女人群超重的患病率分別是61.33%和60.77%，較其他民族偏高，同時還顯示維吾爾族是超重、腹型肥胖的高發(fā)人群〔2〕。陶義存等〔3〕的研究也提示，維吾爾族腹型肥胖是誘發(fā)脂代謝紊亂、2型糖尿病的危險因素。最近的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)在調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、脂肪代謝通路上起著重要的作用〔4〕，參與肥胖〔5～8〕、胰島素抵抗〔5〕、糖尿病〔6〕、炎癥〔7〕的發(fā)生與發(fā)展。因此本研究采用芯片初篩及實時熒光定量PCR方法驗證，初步探討miRNA與維吾爾族肥胖癥的關(guān)系，旨為維吾爾族抗凝全血中miRNA的表達變化與肥胖的相關(guān)性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 TRIzol REAGENT BD(MRC)，異丙醇，氯仿(SIGMA)，miRNeasy mini KitmiScriptⅡ RT Kit、miScript SYBR?Green PCR kit、miScript Primer Assays、10 × miScript Universal Primer(德國Qiagen公司)。低溫高速離心機，渦旋混合器，實時熒光定量PCR熱循環(huán)儀購自ABI公司。

1.2 標本采集 維吾爾族非肥胖與肥胖抗凝全血樣本各5例，用于微列陣芯片實驗，后續(xù)收集維吾爾族抗凝血樣本，非肥胖組∶肥胖組(16例∶12例)用于實時熒光PCR驗證。樣本采自新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌VIP二病區(qū)。樣本均為受調(diào)查者早晨空腹的新鮮抗凝血樣。該方案已通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的審查，同時征得研究個體的同意并填寫了知情同意書。肥胖分型根據(jù)國際和亞太地區(qū)推薦對肥胖診斷的標準〔9〕，BMI＞25 kg/m2為肥胖，同時排除高血壓、高血脂、糖尿病以及糖耐量異常者。

1.3 方法

1.3.1 臨床指標的測定 受試者脫鞋、免冠，測量身高、體重、腰圍、臀圍，并計算BMI。測量兩次收縮壓與舒張壓，并取平均值;采集肘靜脈血5 ml，分別測空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等生化指標，胰島素抵抗指數(shù)(IR)用最小穩(wěn)態(tài)模型方法判定，公式為:HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mU/L)/22.5。

1.3.2 微列陣芯片雜交 按照說明書TRI REAGENT BD的方法提取總RNA，測其質(zhì)量濃度及完整性。分離RNA，采用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power標記試劑盒進行miRNA標記。采用miRCURYTM LNA microRNA芯片對Hy3TM標記樣品進行雜交，后采用Axon GenePix 4000B微陣列芯片掃描儀掃描，最后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.3.3 抗凝血中提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄 用TRI REAGENT BD的方法提取總RNA樣品;在冰上準備反轉(zhuǎn)錄的體系根據(jù)miScriptⅡ RT Kit試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，在37℃孵育60 min，95℃孵育5 min條件下合成單鏈cDNA。

1.3.4 實時熒光定量PCR 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板2 μl，配制PCR總反應(yīng)體系20 μl。參照miScript SYBR?Green PCR kit說明書試劑盒說明操作，進行實時熒光定量PCR擴增。反應(yīng)條件:預變性 95℃ 15 min，變性94℃ 15 s，退火 55℃ 30 s，延伸70℃ 35 s，40個循環(huán)。每個樣本重復2次。

2 結(jié)果

2.1 芯片檢測結(jié)果 采用的miRCURY LNATM microRNA Array含有miRBase 16.0公布的人源、小鼠、大鼠、及病毒miRNA。雜交后miRNA芯片經(jīng)掃描、軟件分析及標準化處理，同時也經(jīng)過3種生物信息學靶基因軟件預測，結(jié)果顯示在維吾爾族肥胖組與非肥胖組比較，foldchange值為0.246倍，miRNA130a在維吾爾族肥胖組中顯著低表達，表達量差異有統(tǒng)計學意義〔(0.28±0.13)vs(1.14±0.32)，P ＜0.05〕。

2.2 維吾爾族肥胖與非肥胖組間體檢及生化指標的比較 肥胖組身高、體重、體重指數(shù)、腰圍和腹圍、收縮壓均大于非肥胖組，并且差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。其余指標在兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果也說明維吾爾族肥胖人群具有腹型肥胖的特征，其中FPG和HDL-C的數(shù)據(jù)需要正態(tài)變換。見表1、表2。

表1 維吾爾族肥胖與非肥胖組間體檢指標的比較(±s)

表1 維吾爾族肥胖與非肥胖組間體檢指標的比較(±s)

與非肥胖組比較:1)P﹤0.05

腰臀比非肥胖組 5 48±11 164±0.05 60.81±6.86 22.63±2.24 82.86組別 n 年齡(歲) 身高(cm)體重(kg)體重指數(shù)(kg/m2)腰圍(cm)臀圍(cm)±8.53 95.71±2.13 0.91±0.03肥胖組 5 55±12 166±0.06 87.02±11.181) 31.48±4.131) 103.81±10.301)109.10±10.401)0.95±0.07

表2 維吾爾族肥胖與非肥胖組間生化指標的比較(±s)

表2 維吾爾族肥胖與非肥胖組間生化指標的比較(±s)

與非肥胖組比較:1)P﹤0.05;FPG、HDL-C經(jīng)過正態(tài)性變換

HOMA-IR非肥胖組 5 0.76±0.18 2.77±0.61 1.82±0.37 1.10±0.08 2.組別 n FPG(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)SBP(mmHg)DBP(mmHg)胰島素(mU/L)56±0.47 110±15 67±8 16.74±1.71 4.57±0.90肥胖組 5 0.82±0.18 3.62±0.24 2.27±0.57 1.11±0.06 3.18±0.26 130±181)79±9 12.73±1.76 4.54±1.41

2.3 RT-PCR檢測miRNA130a在維吾爾族肥胖和非肥胖組抗凝全血中表達 本實驗中實時熒光定量采用相對定量中法的比較Ct法進行定量。目的基因的量(RQ)=2－△△Ct(以校正后的2－△△Ct比較樣本間的基因表達差異)。實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示:miRNA130a在維吾爾族肥胖與非肥胖組外周抗凝全血組間的表達量表達變化有統(tǒng)計學意義〔(4.12±1.06)vs(1.27±0.27)，P＜0.05〕。在維吾爾族肥胖組的miRNA130a的表達量下降，這一結(jié)果與芯片的結(jié)果有一致性。另外，miRNA130的擴增曲線和熔解曲線都說明了實時熒光定量PCR產(chǎn)物的特異性較好。

2.4 miRNA130a與維吾爾族肥胖組和非肥胖組中臨床指標的相關(guān)分析 在維吾爾族肥胖與非肥胖組這個研究對象總體中，miRNA130a的表達量與 FPG呈負相關(guān)(r=－0.389，P＜0.05)，與TC呈負相關(guān)(r= －0.409，P＜0.05)，與 HDL-C呈正相關(guān)(r=0.368，P＜0.05)，而與身高、體重、腰圍、臀圍、腰臀比、收縮壓、舒張壓、TG、LDL-C、HOMA-IR無相關(guān)。提示隨著miRNA130a的表達量增加，空腹血糖和總膽固醇的水平會逐漸下降，HDL-C的水平會逐漸上升。

3 討論

肥胖是指體內(nèi)脂肪堆積過多和(或)分布異常、以體重增加為主要特征的代謝異?！?0〕。它的發(fā)生是機體能量代謝失調(diào)的結(jié)果，其確切的發(fā)病機制未全明了，目前認為與遺傳因素、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、內(nèi)分泌功能紊亂、代謝因素和營養(yǎng)因素不平衡等有關(guān)。肥胖會帶來一系列生理功能的改變，可以誘發(fā)與心血管疾病相關(guān)的多種代謝功能異常，會增加T2DM、冠心病、充血性心力衰竭、高血壓、脂質(zhì)異常血癥及某些癌癥(如卵巢癌、胸腺癌和結(jié)腸癌)等的發(fā)病率和死亡〔11〕。因此，肥胖已經(jīng)嚴重影響人類的健康，而脂肪細胞的分化直接影響著這些疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在細胞生物學方面肥胖主要表現(xiàn)為脂肪細胞在數(shù)量上的異常增加和體積上的異常增大，因此成脂分化一直是肥胖研究的重要方向〔12〕。

miRNA對多種生理病理過程具有重要的調(diào)控作用，諸如細胞的增殖與凋亡，細胞的分化，生物體的生長發(fā)育，腫瘤的形成等〔13〕。miRNA是一大類內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與靶基因3'-UTR的配對，促進mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達〔14〕。其占人類已預測基因的3%以上，調(diào)控約30%的蛋白編碼基因〔15〕。自 2003年 Xu等〔16〕首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)miRNA14對調(diào)控脂肪代謝具有重要調(diào)節(jié)作用以來，研究者對這一新的調(diào)節(jié)方式產(chǎn)生了濃厚的興趣。Esau等〔17〕的研究識別了對脂肪細胞分化有促進作用的miRNA143。Poy等〔18〕在胰腺內(nèi)分泌的細胞中克隆并識別了進化保守的胰島-特異miRNA375。2007年，He等〔19〕研究表明糖尿病鼠中 miRNA29過度表達導致3T3-L1前體脂肪細胞胰島素抵抗。這些都表明miRNA在脂肪細胞的分化發(fā)面起了舉足輕重的作用。因此，miRNA在脂肪生成的調(diào)節(jié)及肥胖的研究中成為熱點〔12〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在維吾爾族肥胖組抗凝全血中miRNA130a的表達量也降低，這一結(jié)果與芯片結(jié)果有一致性。同時有研究表明，miRNA130調(diào)節(jié)脂肪細胞生成，miRNA130a、b在成脂細胞中比在前脂肪細胞中的表達量低〔4〕。此研究與本實驗結(jié)果都提示miRNA130a可能參與了脂肪成脂分化過程，進一步也提示miRNA130a的表達量下降可能與BMI≥25的維吾爾族肥胖相關(guān)。

文獻報道由于單純體重不能充分反映體內(nèi)脂肪的含量，體重指數(shù)這一指標考慮了體重和身高個因素，可反映全身性超重和肥胖癥，腰圍是反映脂肪總量和脂肪分布結(jié)構(gòu)的綜合指標，可代替腰臀比預測中央性脂肪含量〔10〕。本實驗結(jié)果說明miRNA130a與血糖、血脂有相關(guān)性，也提示若在維吾爾肥胖組miRNA130a表達水平升高，那么空腹血糖、總膽固醇以及HDL-C水平也許可能會有改善。

目前研究表明差異表達的miRNAs在參與調(diào)節(jié)脂肪組織代謝通路上有其特定的靶基因與功能〔20〕。Esau等〔17〕利用生物信息學預測 miRNA143的靶標是ERK5，通過實驗也表明miRNA143可能通過靶基因 ERK5參與脂肪細胞分化。Wilfred等〔21〕發(fā)現(xiàn)了miRNA相似物miRNA103/107，它們能夠?qū)Υx途徑進行調(diào)控miRNA，生物信息學預測 miRNA103/107是通過影響細胞內(nèi)乙酰-COA來調(diào)控脂類代謝。本研究發(fā)現(xiàn)有:PPARγ，TNF，CD69，SOXZ1等多個靶基因，這些靶基因分別涉及脂肪分化，免疫調(diào)節(jié)，硫代謝、信號轉(zhuǎn)導等多種功能，后續(xù)我們也將繼續(xù)進行功能研究，驗證這些靶基因?qū)S吾爾族肥胖可能的調(diào)節(jié)作用。

目前雖已經(jīng)明確miRNA130a在脂肪細胞分化發(fā)面起了舉足輕重的作用，但是miRNA130a是通過何種方式引起脂肪細胞分化及肥胖改變的，目前還不十分清楚，這也有待進一步研究。目前，用實驗方法和計算機生物信息學手段明確了在維吾爾族肥胖人群miRNA130a及其靶標，這也為揭示它的功能奠定了基礎(chǔ)。因此，在此基礎(chǔ)之上探明miRNA130a對脂肪細胞分化的具體調(diào)節(jié)作用以及作用機制將是對研究維吾爾族肥胖調(diào)控的相關(guān)理論提供新的理論依據(jù)，這研究必將成為防治與脂肪細胞分化及肥胖有關(guān)的代謝性疾病提供新的治療方向。

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