李卓穎，韓冬，江杰，陳志衡，陳佳，田朗，黃利華，楊作成

川崎病患兒血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1基因373位點(diǎn)及1688位點(diǎn)基因多態(tài)性研究

李卓穎，韓冬*，江杰，陳志衡，陳佳，田朗，黃利華，楊作成

目的：研究血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1(PECAM-1）基因373C/G及1688A/G基因多態(tài)性及其與川崎病(KD）發(fā)病、并發(fā)冠狀動(dòng)脈損傷(CAL）之間的關(guān)聯(lián)。

方法：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)——限制性片斷多態(tài)性分析（PCR-RFLP）技術(shù)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，檢測(cè)44例川崎病患兒(川崎病組)和59例正常對(duì)照組兒童PECAM-1基因373C/G及1688A/G的基因型和等位基因分布。

結(jié)果：①川崎病組PECAM-1基因373 C/G的等位基因頻率與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.11，P＞0.05)，CC、GG、CG基因型分布與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.49，P＜0.05)，川崎病組中并CAL者與無CAL者基因型分布頻率和等位基因頻率比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.19、1.004，P均＞0.05)；②川崎病組PECAM-1基因1688 A/G的等位基因頻率及AA、GG、AG基因型分布與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.04、0.24，P均＞0.05），川崎病組中并CAL者與無CAL者基因型分布頻率和等位基因頻率比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.376、0.0004，P均 ＞0.05)。

結(jié)論：PECAM-1基因373C/G在川崎病中基因型構(gòu)成存在差異，但與CAL的發(fā)生無明顯相關(guān)性。PECAM-1基因1688A/G與川崎病及其CAL的發(fā)生均無明顯相關(guān)性。

血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1基因；基因多態(tài)性；皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征；兒童

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:285.)

川崎?。↘D）又稱皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征，是以全身血管炎為主要病理表現(xiàn)的發(fā)熱出疹性疾病，其具體發(fā)病機(jī)制尚不甚明確，研究顯示其與免疫失調(diào)和多種血管活性因子引起的血管損傷有關(guān)[1]。血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1(PECAM-1）可能是血小板表面唯一的黏附因子，在細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)PECAM-1基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病有關(guān)[2，3], 但該基因多態(tài)性與川崎病及其所致冠狀動(dòng)脈（冠脈） 損傷（CAL）是否存在相關(guān)性尚少見報(bào)道。

1 資料和方法

研究對(duì)象 選取2006-01至2010-08在我院就診的川崎病患兒44例(川崎病組)，均符合日本川崎病研究會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，即在下述6條主要臨床癥狀中至少要滿足5條才能確診: ①不明原因發(fā)熱, 持續(xù)5天或更久。②雙側(cè)結(jié)膜充血。③口腔及咽部粘膜彌漫充血, 唇發(fā)紅及干裂, 并呈楊梅舌。④發(fā)病初期手足硬腫和掌跖發(fā)紅, 以及恢復(fù)期指趾端出現(xiàn)膜狀脫皮。⑤軀干部多形紅斑, 但無水皰及結(jié)痂。⑥頸淋巴結(jié)的非化膿性腫脹，直徑≥1.5 cm。但如超聲心動(dòng)圖或冠脈造影查出冠脈瘤或擴(kuò)張，則4條主要癥狀陽性即可確診。44例患兒均為漢族，年齡7個(gè)月～7歲，其中男30例，女14例，平均年齡（2.4±1.4）歲。其中川崎病合并 CAL的診斷指標(biāo)[5]為：冠脈內(nèi)徑：①～3歲＜2.5 mm，～9歲＜3 mm，～14歲＜3.5 mm；②某段血管直徑為鄰近段的1.5倍及以上；③管壁明顯不規(guī)則。正常對(duì)照組：選取中國湖南省健康體檢的漢族兒童59例，排除感染性疾病、心血管疾病、風(fēng)濕性疾病等，并排除既往川崎病病史。年齡9個(gè)月～9歲，其中男30例，女29例，平均年齡為（3.8±1.9）歲。兩組的性別構(gòu)成、年齡分布經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。為進(jìn)一步了解川崎病及其所致CAL是否存在相關(guān)性，將川崎病組又分為并CAL者與無CAL者。本研究均經(jīng)患兒家長或法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書，并獲得我院醫(yī)療及科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

方法 血液標(biāo)本的收集和處理：用一次性采血管（含抗凝劑EDTA-K2）取靜脈血2 ml，血液標(biāo)本立即移入凍存管并置于-80℃保存，采用PureGene DNA提取試劑盒(美國Gentra公司)，按照說明書的要求提取血液基因組基因?；蚪M基因提取完畢后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因多態(tài)性檢測(cè) 通過聚合酶鏈反應(yīng)——限制性片斷多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)受試者的PECAM-1基因373C/G（dbSNP ID：668）及 PECAM-1基因 1688A/G（dbSNP ID：17354990）的基因多態(tài)性。①引物的合成：373C/G上游引物序列：F：5-GCA CCA CCT CTC ACG TCA AG-3，下游引物序列: R：5-CTG TGC TCA GTT CCA AGG AC-3’；1688A/G 上游引物序列：F：5’-TGT GAA TCC TTT TCC TGC TTT TC-3；下游序列 : R：5-GCT TGC TAT GGA GAC CCT GAC-3。 由上海生物工程公司合成。②目的基因的擴(kuò)增：反應(yīng)體系共20μl，Premix Taq10μl，上、下游引物(1μ mol/L)各1 μl，稀釋基因模板2 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min (94℃變性1 min，62℃退火l min，72℃延伸l min)×35個(gè)周期后，最后72℃延伸15 min。產(chǎn)物經(jīng)2%凝膠電泳檢查。③基因型檢測(cè)：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行內(nèi)切酶酶切消化，反應(yīng)體系如下：18 μl去離子水，2 μl Buffer G緩沖液，10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，1 μl內(nèi)切酶（373C/G及1688A/G內(nèi)切酶分別為 Pvu II 及Nhe I，均由美國Fermentas公司提供）。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%凝膠電泳后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)采用SPSS l3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)，然后經(jīng)Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，表明各基因型頻率已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

2 結(jié)果

擴(kuò)增結(jié)果：血液標(biāo)本提取所得基因組基因經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)，示光密度（OD）260/OD 280值為1.7～2.0，均符合實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷多態(tài)性技術(shù)擴(kuò)增得到PECAM-1基因373C/G基因片段為225 bp，1688A/G基因片段為338 bp。結(jié)果與預(yù)期一致。圖1、圖2

圖1 PECAM-1基因373C/G擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 PECAM-1基因1688A/G擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性的基因型檢測(cè)：①PECAM-1基因373C/G多態(tài)性的基因型: PECAM-1基因373C/G多態(tài)性呈C、G二態(tài)，C等位基因含1個(gè)Pvu II酶切位點(diǎn)，而G等位基因不含Pvu II酶切位點(diǎn)，故CC型為188 bp、37 bp兩條電泳帶(因37 dp片段太小，條帶不能顯示)，GG型為255 bp一條電泳帶，CG型為255 bp、188 bp、37 bp三條電泳帶。結(jié)果與預(yù)期一致（圖3）。②PECAM-1基因1688A/G多態(tài)性的基因型：PECAM-1基因1688A/G多態(tài)性呈A、G二態(tài)，G等位基因含1個(gè)Nhe I酶切位點(diǎn)，而A等位基因不含Nhe I酶切位點(diǎn)，故AA型為338 bp一條電泳帶，GG型為219 bp、119 bp兩條電泳帶，AG型為338 bp、219 bp、119 bp三條電泳帶。結(jié)果與預(yù)期一致。圖4

圖3 PECAM-1基因373C/G多態(tài)性酶切后電泳圖

圖4 PECAM-1基因1688A/G多態(tài)性酶切后電泳圖

Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測(cè)：①PECAM-1基因373C/G基因型頻率在川崎病組、正常對(duì)照組分布經(jīng)Hardy-Weinberg吻合度檢測(cè)分別為χ2=1.33、0.77，P均＞0.05。②PECAM-1基因1688A/G基因型頻率在川崎病組、正常對(duì)照組分布經(jīng)Hardy-Weinberg吻合度檢測(cè)分別為χ2=2.32、1.44，P均＞0.05。說明研究對(duì)象來自大群體，個(gè)體間是隨機(jī)分配，具有群體代表性。

PECAM-1基因373C/G及1688A/G的基因型分布及等位基因頻率比較：① 373C/G的基因型分布及等位基因頻率比較（表1）： 川崎病組PECAM-1基因373C/G的CC、GG、CG基因型分布與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.49，P＜0.05），川崎病組的C、G等位基因頻率與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.11，P＞0.05）；川崎病組中并CAL者與無CAL者的基因型分布和等位基因頻率比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.19、1.004，P均＞0.05)。②1688A/G的基因型分布及等位基因頻率比較（表2）：川崎病組PECAM-1基因1688A/G的A、G等位基因頻率及AA、GG、AG基因型分布與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.04、0.24，P均＞0.05），川崎病組中并CAL者與無CAL者的基因型分布和等位基因頻率比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.376、0.0004，P均 ＞0.05)。

表1 PECAM-1基因373C/G基因型分布及等位基因頻率比較

表2 PECAM-1基因1688A/G基因型分布及等位基因頻率比較

3 討論

川崎病主要累及中小動(dòng)脈，特別是冠脈，嚴(yán)重者會(huì)形成冠脈瘤[1,6]。病因尚不完全明確，而研究證實(shí)其發(fā)病與遺傳因素有關(guān)[7]。PECAM-1是一種血小板上主要跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族，多分布于脈管細(xì)胞及炎癥細(xì)胞[8]。PECAM-1的基因多態(tài)性會(huì)影響其生理功能，其多態(tài)性位點(diǎn)主要包 括 373 C/G(Leu l25Val)、1688A/G (Ser563Asn)。373 C/G(Leu l25Val)突變位置位于Ig的細(xì)胞外區(qū)的第一個(gè)環(huán)上[9]，其生理作用與嗜同性黏附反應(yīng)、白細(xì)胞的跨皮遷移有關(guān)。當(dāng)該位點(diǎn)發(fā)生突變后，表達(dá)氨基酸發(fā)生改變，PECAM-1黏附功能會(huì)發(fā)生改變，使整合素β1、β2h、β3活化，介導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮的黏附增強(qiáng)，之后隨白細(xì)胞穿越內(nèi)皮細(xì)胞間連接，激發(fā)整合素或蛋白酶的釋放，通過異嗜性作用使白細(xì)胞穿越基底膜，使血管內(nèi)皮功能改變，為之后的血管內(nèi)皮損傷奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)Leu l25Val基因多態(tài)性位點(diǎn)與血清可溶性PECAM-1表達(dá)有關(guān)，該位點(diǎn)基因多態(tài)性與冠脈擴(kuò)張存在關(guān)聯(lián)，且125Val純合子高表達(dá)[10,11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PECAM-1基因373C/G的CC、GG、CG基因型頻率在川崎病組與正常對(duì)照組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異；而C、G等位基因頻率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；川崎病并CAL者與無CAL者比較，CC、GG、CG基因型頻率及C、G等位基因頻率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PECAM-1基因373C/G多態(tài)性在川崎病中基因型構(gòu)成存在差異，但與CAL的發(fā)生無明顯相關(guān)性。1688A/G(Ser563Asn)由第8外顯子表達(dá)，突變位置位于Ig第六環(huán)區(qū)[9]，該位點(diǎn)突變后，信號(hào)介導(dǎo)及激活整合素活動(dòng)增強(qiáng)，對(duì)于細(xì)胞核內(nèi)PECAM-1基因的表達(dá)發(fā)揮了正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，從而使可溶性PECAM-1水平升高[12]，導(dǎo)致血流中白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，貼壁白細(xì)胞遷移至內(nèi)皮細(xì)胞下形成泡沫細(xì)胞，加重了血管壁的炎性反應(yīng)，誘發(fā)冠脈疾病及腦卒中事件。全身血管炎是川崎病主要的病理表現(xiàn)，也與其所致的CAL有關(guān)，可能該位點(diǎn)基因多態(tài)性與川崎病存在關(guān)聯(lián)。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PECAM-1基因1688A/G在川崎病組與正常對(duì)照組比較，AA、GG、AG基因型頻率及A、G等位基因頻率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；川崎病并CAL者與無CAL者比較，AA、GG、AG基因型頻率及A、G等位基因頻率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異亦無意義。提示PECAM-1基因1688A/G多態(tài)性可能未參與川崎病及其CAL的發(fā)生。

川崎病發(fā)病與多因素有關(guān)，基因多態(tài)性對(duì)其發(fā)病的影響尚少見在研究中。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川崎病組PECAM-1基因373C/G的CC、GG、CG基因型分布與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明PECAM-1基因多態(tài)性與川崎病發(fā)病可能存在關(guān)聯(lián)，但2個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性均未發(fā)現(xiàn)與其所致的CAL存在相關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量不大，PECAM-1基因與川崎病發(fā)生發(fā)展的確切關(guān)系尚待大樣本病例的研究以進(jìn)一步證實(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果可作為進(jìn)一步研究的參考。

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（編輯：梅平）

Gene Polymorphism Study for Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Gene at Loci 373 and 1 688 in Children With Kawasaki Disease

LI Zhou-ying, HAN Dong, JIANG Jie, CHEN Zhi-heng, CHEN Jia, TIAN Lang,HUANG Li-Hua, YANG Zuo-cheng.
Department of Pediatrics, Xiangya Third Hospital, Centre Southern University,Changsha (410013), Hunan, China

YANG Zuo-cheng, Email: yang_zcr@126.com

Objective: To investigate the relationship between platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) gene polymorphisms at loci 373 C/G, 1688 A/G and the risk of Kawasaki disease (KD) complicated by coronary artery lesions (CAL)in pediatric patients.

Methods: Our research included 2 groups, KD group, n=44 pediatric patients and Control group, n=59 healthy children.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was conducted to examine and compare the polymorphism of PECAM-1 gene at loci 373 C/G and 1688 A/G in both groups.

Results: ①There was no real differences between KD group and Control group for allele frequencies at locus 373 C/G ( χ2=1.11, P＞0.05) polymorphism of PECAM-1 gene. While the genotype frequencies of CC, GG and CG were different between KD group and Control group ( χ2=8.49, P＜0.05). In KD group, the genotype frequency and allele frequency were similar between the patients with or without CAL (χ2=5.19, 1.004, P＞0.05 respectively). ② There were no real differences between KD group and Control group for allele frequencies at locus 1688 A/G polymorphism, and for genotype frequencies of AA, GG, AG (χ2=0.04, 0.24, P＞0.05 respectively). In KD group, the genotype frequency and allele frequency were similar between the patients with or without CAL (χ2=0.376, 0.0004, P＞0.05 respectively).

Conclusion: PECAM-1 gene polymorphism at locus 373 C/G is different in KD children, while it is not related to CAL occurrence. The polymorphism at locus 1688A/G was not related to KD incidence.

Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 gene; Gene polymorphism; Mucocutaneous lymph node syndrome;Children

410013 湖南省長沙市，中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 兒科

李卓穎 主治醫(yī)師 碩士 主要從事兒科臨床和基礎(chǔ)研究 Email: lizhuoying1983@163.com*為并列第一作者通訊作者：楊作成 Email: yang_zcr@126.com

R541.4

A

1000-3614（2013）04-0285-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.04.014

2012-08-28）