魏亞松，鄒 玲，溫建新，劉文華，邵 嶧

（1.青島農業(yè)大學 動物科技學院，山東青島 266109；2.青島安普動物營養(yǎng)品制造有限公司，山東青島 266061）

長期以來，飼料中添加抗生素等添加劑雖對預防畜禽疾病有明顯的作用，但隨著抗生素的普及甚至濫用，造成病菌產生耐藥性、藥物殘留及環(huán)境污染等諸多不利影響，直接危害人類健康。在這種情況下，益生菌作為一種無毒、無害、無殘留、無抗藥性的綠色飼料添加劑，就已成為動物疾病防治的一個新方向[1]。歐洲許多國家已禁止使用抗生素作為促生長劑，因此尋求無毒副作用、無藥物殘留的微生態(tài)飼料添加劑已成為研究熱點[2-3]。

枯草芽孢桿菌是農業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，其制劑為無毒、無殘留、無污染的綠色添加劑。據(jù)雷愛瑩等報道[4]其具有改善消化道內環(huán)境、促進動物生長、提高動物機體免疫力及產生多種酶類、提高消化酶活性等功能而備受青睞，故具有廣闊的發(fā)展前景。據(jù)李俊波報道[5]在蛋雞日糧中添加枯草芽孢桿菌制劑具有改善料蛋比、降低死淘率和雞蛋破損率，并且顯著提高了日糧粗蛋白和有機物消化率。溫海燕和雷愛瑩等報道[3-4]其在飼料添加劑、污水處理、疫苗載體等各方面已經得到了廣泛的應用，顯示了巨大的社會效益和生態(tài)效益。

枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮巨大作用，已經得到廣泛的應用[6]。大部分都是針對雞、豬、水產等的，很少見有資料報道在水貂等特種經濟毛皮動物中。本試驗從健康水貂腸道中分離鑒定枯草芽孢桿菌，以期為進一步深入研究提供參考，并為水貂等毛皮動物的微生態(tài)制劑應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 健康成年丹麥紅眼母貂。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術公司。

1.1.3 主要試劑 革蘭氏染色液、5%孔雀綠染液、0.5%沙黃溶液、糖醇發(fā)酵管（葡、麥、蔗、乳、甘、木、果、七葉苷等）、硝酸鹽還原試驗甲液和乙液、3%過氧化氫、明膠、碘液等。DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；TE緩沖液，Premixed Taq（incl dye）、DL 2000 DNA Marker、電泳級瓊脂糖Agarose Regular購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、高壓蒸氣滅菌鍋、光學顯微鏡、電子天平、DYY-Ⅲ-7型電泳儀、AlphaView S A凝膠成像分析儀和721型紫外分光光度計等。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 取腸黏膜和糞便樣品1 g，置于含有PBS緩沖液的三角瓶（含玻璃珠）中，取上清液加入離心管離心，2000 r/min離心10 min，置于80℃的水浴鍋內水浴30 min[7-8]。

1.2.2 菌株的分離純化 取菌液接種于普通培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h；挑取疑似菌落進行純化培養(yǎng)。

在折騰了兩天以后，我被三根高大杉木支起的一個葫蘆瓜子滑輪牽引扯出了地面。他們鋸掉我四周伸張的樹根，把帶土的根部用草要子纏繞包裹起來，并在上面灑了水，以保持我基本的生存需求。

1.3 染色鏡檢

1.3.1 革蘭氏染色 挑取單菌落，在載玻片上進行抹片，待其干燥固定后，進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.3.2 芽孢染色 挑取單菌落，抹片經火焰固定后滴加5%孔雀綠水溶液加熱30～60 s使其產生蒸汽4次，水洗；滴加0.5%沙黃液1 min，水洗吸干鏡檢[9]。

1.4 生理生化試驗 按照常規(guī)實驗方法[9-10]對分離菌進行糖苷醇發(fā)酵試驗、甲基紅（MR）試驗、乙酰甲基甲醇試驗（VP試驗）、淀粉水解試驗、吲哚試驗、TSI試驗、脲酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗等生理生化試驗，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察結果。

1.5 16 S rRNA的PCR擴增和序列分析

將分離的菌株接種于5 mL營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，取4 mL菌液10000 r/min離心2 min，參考《精編分子生物學室驗指南》[11]的方法提取DNA。

在參考了國內外相關文獻[12-14]后，確定一對芽孢桿菌屬特異性引物：正向引物Primer A：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，反向引物Primer B：5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR產物經試劑盒純化后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序結果使用DNAStar7.1軟件包中的SeqMan進行序列拼接。采用BLAST和與GenBank數(shù)據(jù)庫中已收錄的芽孢桿菌屬16 S rRNA的序列比對，并使用MegAlian中的Clustal X Method進行同源性比較[16-17]。

2 結果與分析

2.1 菌落形態(tài)和菌體形態(tài)結果

將從健康水貂腸道中分離的菌命名為P2。菌落呈灰白色、無光澤，表面粗糙，菌落邊緣不整齊，為干燥型菌落（圖1a）。革蘭氏染色為陽性，菌體呈長桿狀，芽孢中生，橢圓形（圖1b）。芽孢染色，芽孢被染成綠色，菌體呈紅色（圖1c）。

2.2 生理生化試驗結果

分離菌P2的生理生化試驗結果見表1。

根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》[18]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]，上述結果均符合枯草芽孢桿菌的生化特性，證明分離菌為枯草芽孢桿菌。

表1 P2菌的生理生化試驗結果

2.3 PCR鑒定結果 對菌株P2進行芽孢桿菌屬的PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示有特異性條帶（圖2），證明菌株P2為芽孢桿菌屬。

將分離的P2菌株與其他14個從GenBank下載的國內外分離的芽孢桿菌屬的基因序列進行同源性比較。結果顯示比對的幾個菌株的同源性均在99.0%～99.9%之間（圖3）。由圖3可知，P2菌株的核酸序列與Bacillus subtilis strain CICC 10023（GU980947.1）的同源性最高，達到了99.9%，因此該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌。

3 討論

芽孢是某些革蘭氏陽性菌在一些不適宜的條件下，在菌體內形成的一個圓形或卵圓形的休眠體。所以本試驗采用將樣品進行80 ℃高溫處理30 min，然后進行分離篩選。此外，本試驗凝膠電泳結果比預期的偏大些，但是PCR產物的測序結果卻與預期擴增片段相符，這說明不能僅通過凝膠電泳圖來判斷結果，還需通過測序及序列分析確定結果。

本試驗通過菌落形態(tài)觀察、革蘭染色、芽胞染色和生理生化特性方法對分離菌株的鑒定，與張紅英等[20]從人工飼養(yǎng)的健康三黃肉雞的盲腸和大腸中分離出了枯草芽胞桿菌的結果一致；本試驗通過16S rRNA序列分析對分離菌株P2與從GenBank下載的國內外分離的芽孢桿菌屬進行核酸序列的同源性比較，結果顯示比對的幾個菌株的同源性均在99.0%～99.9%之間；與周宏璐等[21]通過16S rDNA序列分析對從養(yǎng)豬場健康成年豬糞便中分離的1株芽孢桿菌進行鑒定，序列分析與枯草芽孢桿菌相似度為98.99%的結果相符。但在水貂腸道中，分離出枯草芽孢桿菌的報道尚屬首次。

枯草芽孢桿菌廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)，芽孢桿菌被制為活菌制劑已廣泛應用于豬和家禽等動物以及水產養(yǎng)殖業(yè)中，但在毛皮動物特別是水貂養(yǎng)殖上，應用研究相對較少?？莶菅挎邨U菌在大多數(shù)動物腸道中被認為是過路菌[22]，但在水貂腸道中分離出該菌，說明該菌對水貂有一定作用，具體機理有待于進一步研究。

4 結論

本研究從健康水貂的腸道中分離純化出1株枯草芽孢桿菌，命名為P2，通過形態(tài)學觀察、生理生化試驗以及16 S rRNA序列分析進行綜合鑒定。結果表明P2菌株菌落呈灰白色、邊緣不整齊；革蘭氏染色為陽性，菌體呈長桿狀，芽孢中生，橢圓形；能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖等多種碳源；通過對菌株的擴增、測序和分析可知，顯示菌株P2與菌株 Bacillus subtilis CICC 10023（GU980947.1） 親緣關系最近，同源性達到了99.9%，因此鑒定P2菌株為枯草芽孢桿菌。

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