張海明，鄭麗蘭，段曉冬，相文華，沈 丹，薛 紅，梁卓粵，彭南秀，程 忠，彭 聰

（1.廣州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 廣州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510440；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150001）

馬病毒性動(dòng)脈炎（equine viral arteritis，EVA）是由馬動(dòng)脈炎病毒（equine arteritis virus，EAV）所引起的馬屬動(dòng)物的一種接觸性傳染性病毒病[1]。該病早先發(fā)現(xiàn)于美國(guó)俄亥俄州，并由Doll等人從馬流產(chǎn)胎兒中首次分離出馬動(dòng)脈炎病毒[2]。目前，馬病毒性動(dòng)脈炎存在于世界各地的馬群中[3]。該病多呈亞臨床感染，也可引發(fā)不同程度的癥狀，比如發(fā)燒、精神沉郁、食欲減退、四肢以及陰囊和包皮墜性水腫、結(jié)膜炎、皮膚麻疹塊和流產(chǎn)等。在幼駒，雖然不多見，但可暴發(fā)肺炎或肺腸炎。除了馬駒之外，其他日齡馬感染后病死率通常都很低，感染馬幾乎毫無例外都能完全臨床康復(fù)，但很大一部分種公馬會(huì)長(zhǎng)期帶毒，而母馬、去勢(shì)馬和性未成熟的小馬尚未發(fā)現(xiàn)有帶毒現(xiàn)象。

馬病毒性動(dòng)脈炎是我國(guó)的二類動(dòng)物疫病，也是全世界各國(guó)進(jìn)出口檢疫非常重視的馬屬動(dòng)物疫病之一。該病的診斷方法主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光試驗(yàn)、瓊擴(kuò)試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)戏磻?yīng)技術(shù)和病毒分離等。其中，病毒中和試驗(yàn)由于其敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，被公認(rèn)是馬病毒性動(dòng)脈炎抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]，同時(shí)也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的馬病毒性動(dòng)脈炎診斷方法。但是由于ELISA方法具有操作簡(jiǎn)單、便于大規(guī)模篩查和靈敏度高等特點(diǎn)，目前已有較多ELISA方法成功建立和應(yīng)用的報(bào)道[5-7]。為了解這兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合性，筆者建立了馬病毒性動(dòng)脈炎病毒中和試驗(yàn)，并與ELISA方法進(jìn)行比較，以期為我國(guó)馬病毒性動(dòng)脈炎檢測(cè)工作特別是廣東從化無規(guī)定馬屬動(dòng)物疫病區(qū)維護(hù)工作中馬病毒性動(dòng)脈炎檢測(cè)方法的選擇提供借鑒。

1 材料

1.1 RK-13細(xì)胞系

兔腎細(xì)胞（RK-13細(xì)胞）系由廣東省出入境檢驗(yàn)檢疫局惠贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)用試劑

MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶EDTA購自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 病毒和血清

馬病毒性動(dòng)脈炎病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株（Bucyrus株）由廣東省出入境檢驗(yàn)檢疫局惠贈(zèng)；標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自美國(guó)NVSL；馬病毒性動(dòng)脈炎標(biāo)準(zhǔn)陰性血清批號(hào)為372EDV0201，中等抗體效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清批號(hào)為370EDV1101，高抗體效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清批號(hào)為999-EOS-EVA；馬鼻肺炎陽性血清、馬傳染性貧血陽性血清和馬流感陽性血清由中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

馬血清來自廣東省部分地區(qū)馬場(chǎng)，由本實(shí)驗(yàn)室采集并保存。

1.4 豚鼠補(bǔ)體

豚鼠補(bǔ)體購自美國(guó)Rockland公司，批號(hào)為22049。

1.5 ELISA試劑盒

馬病毒性動(dòng)脈炎抗體ELISA商品化試劑盒為西班牙INGENASA公司產(chǎn)品，試劑盒批號(hào)為200612。

2 方法

2.1 病毒制備與病毒TCID50的測(cè)定

取馬動(dòng)脈炎病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株1 mL接種于剛長(zhǎng)滿單層的RK-13細(xì)胞上，37 ℃感作1 h后倒去病毒液，再加入含2%胎牛血清的MEM維持液，37 ℃培養(yǎng)30～40 h，每天進(jìn)行觀察，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時(shí)，反復(fù)凍融3次后收集培養(yǎng)液，用Reed-Muench法進(jìn)行病毒TCID50的測(cè)定。

2.2 病毒中和試驗(yàn)操作

將待檢馬血清和標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清于56℃水浴中滅活1 h待用。將待檢馬血清用2%MEM維持液進(jìn)行1:2和1:4稀釋后加入到滅菌V型96孔板中相應(yīng)位置中，并設(shè)置好血清空白對(duì)照。于另一塊滅菌V型96孔板中設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照，用2%MEM對(duì)馬病毒性動(dòng)脈炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清從1:2開始進(jìn)行倍比稀釋。并設(shè)立病毒對(duì)照。

于所有除血清空白對(duì)照外的孔中加入含有10%補(bǔ)體的工作濃度的EAV，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1 h后，將所有液體轉(zhuǎn)移到已準(zhǔn)備好的含有RK-13細(xì)胞的細(xì)胞板的相應(yīng)位置中，每天觀察，48 h后讀取結(jié)果。

2.3 EVA病毒中和試驗(yàn)特異性試驗(yàn)

將馬病毒性動(dòng)脈炎標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清、馬鼻肺炎陽性血清、馬傳染性貧血陽性血清、馬流感陽性血清用EVA微量血清中和試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值比較結(jié)果。

2.4 EVA病毒中和試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)馬病毒性動(dòng)脈炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（高抗體效價(jià)和中抗體效價(jià)）進(jìn)行三次EVA病毒中和試驗(yàn)，記錄檢測(cè)得到的抗體效價(jià)。

2.5 EVA ELISA操作

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，血清樣品OD值大于cut off值（陰性血清對(duì)照OD450+0.2）的判定為陽性，即樣品中存在馬病毒性動(dòng)脈炎抗體；否則為陰性。

3 結(jié)果

3.1 EAV在接種RK-13細(xì)胞約30～40 h即出現(xiàn)50%～75%左右的細(xì)胞出現(xiàn)病變，病變以細(xì)胞大量呈團(tuán)狀、拉絲狀聚集，嚴(yán)重的出現(xiàn)細(xì)胞破碎和脫落。

3.2 根據(jù)Reed-Muench法對(duì)制備的EAV進(jìn)行TCID50的測(cè)定，該批病毒的TCID50為10-6.5/0.1 mL。

3.3 該中和試驗(yàn)用EAV標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清作為對(duì)照，1:2和1:4稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能完全中和工作濃度的馬病毒性動(dòng)脈炎病毒，而1:2和1:4稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清不能中和該病毒。

3.4 用馬傳貧、馬流感和馬鼻肺炎陽性血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，均不能中和EAV，說明本試驗(yàn)方法具有較好的特異性。

3.5 用馬病毒性動(dòng)脈炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（高抗體效價(jià)和中抗體效價(jià)）進(jìn)行三次EVA病毒中和試驗(yàn)，檢測(cè)得到的抗體效價(jià)在±1個(gè)滴度以內(nèi)，說明本試驗(yàn)方法具有較好的重復(fù)性。

4 EVA病毒中和試驗(yàn)的初步應(yīng)用以及與ELISA方法的比較

4.1 兩種方法的結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)189份馬血清分別進(jìn)行了EVA病毒中和試驗(yàn)和ELISA的檢測(cè)，結(jié)果在VNT檢測(cè)中，陽性數(shù)為7份，陰性數(shù)為182份；在ELISA檢測(cè)中，陽性數(shù)為16份，陰性數(shù)為173份，具體見表1。

表 1 馬病毒性動(dòng)脈炎VNT和ELISA檢測(cè)結(jié)果

4.2 兩種方法的比較分析

在ELISA檢測(cè)的16份陽性血清中，VNT檢測(cè)有5份陽性，陽性符合數(shù)為5份，陽性符合率為43.48%（5+5/16+7）；陰性符合數(shù)為171份，陰性符合率為96.34%（171+171/173+182），總符合率為93.12%（5+171/189），具體見表2、3。

表 2 馬病毒性動(dòng)脈炎VNT和ELISA檢測(cè)結(jié)果比較

表 3 馬病毒性動(dòng)脈炎VNT和ELISA檢測(cè)結(jié)果符合率

4.3 ELISA的敏感性與特異性

如果將我們建立的馬病毒性動(dòng)脈炎VNT作為EVA抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，試驗(yàn)中所用ELISA的敏感性和特異性分別為71.43%和93.96%。

5 討論

目前，除了對(duì)馬精子進(jìn)行病毒分離外，馬病毒性動(dòng)脈炎的檢測(cè)主要依靠血清學(xué)方法。雖然病毒中和試驗(yàn)是OIE推薦的馬病毒性動(dòng)脈炎的檢測(cè)方法，但由于病毒中和試驗(yàn)需要較高的實(shí)驗(yàn)條件和操作能力，以及檢測(cè)結(jié)果的出具需要較長(zhǎng)的時(shí)間，各種馬病毒性動(dòng)脈炎抗體ELISA商品化試劑盒應(yīng)運(yùn)而生。但是在過去幾年的廣東從化無規(guī)定馬屬動(dòng)物疫病區(qū)馬病監(jiān)測(cè)工作中[8]，我們發(fā)現(xiàn)馬病毒性動(dòng)脈炎ELISA的檢測(cè)結(jié)果與VNT的檢測(cè)結(jié)果存在較大的差異，因此，我們建立了適合本實(shí)驗(yàn)室的馬病毒性動(dòng)脈炎病毒中和試驗(yàn)，并與商品化的EVA ELISA試劑盒進(jìn)行比較。

根據(jù)我們的比較結(jié)果，ELISA方法能檢出更多的陽性結(jié)果，這可能與ELISA方法本身可能產(chǎn)生較多的假陽性有關(guān)[9]。另外，EVA VNT檢測(cè)到的是中和抗體，而ELISA檢測(cè)到的一般情況下是非中和抗體，這也可能是兩者檢測(cè)結(jié)果不同的原因之一。而對(duì)于ELISA無法檢出部分VNT檢測(cè)陽性的血清，另一個(gè)可能的原因是，對(duì)于那些包被GP5蛋白的ELISA方法，目前已發(fā)現(xiàn)有部分EVA毒株編碼GP5的基因發(fā)生一定的改變而導(dǎo)致ELISA無法檢出這些毒株所誘發(fā)的抗體[1]。

我們通過兩種檢測(cè)方法的比較和分析發(fā)現(xiàn)，馬病毒性動(dòng)脈炎VNT和ELISA檢測(cè)馬血清的陰性符合率較高，而陽性符合率較低，因此，如果用ELISA作為EVA檢測(cè)的篩查甚至替代VNT進(jìn)行檢測(cè)，可能會(huì)導(dǎo)致部分陽性血清的漏檢。另外，以我們建立的VNT作為馬病毒性動(dòng)脈炎抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，試驗(yàn)中所用的ELISA方法的敏感性和特異性分別為71.43%和93.96%，與Duthie等[5]的試驗(yàn)結(jié)果一致，說明ELISA方法在檢測(cè)馬病毒性動(dòng)脈炎抗體時(shí)，特異性較高，但也存在敏感性不夠的問題。

綜上所述，我們認(rèn)為在馬病毒性動(dòng)脈炎抗體檢測(cè)中，不能以ELISA替代病毒中和試驗(yàn)，也不能采用以抗體ELISA進(jìn)行篩檢然后對(duì)陽性樣品用病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行確診的方法。

致謝：在本實(shí)驗(yàn)完成過程中得到了愛爾蘭馬病中心、廣東省出入境檢驗(yàn)檢疫中心、山東出入境檢驗(yàn)檢疫中心等單位的大力支持和幫助，在此表示真誠(chéng)的感謝。

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