景秀菊 祁秀娟 劉建新 湯秀明 劉海寧 趙頻

雌激素與心血管疾病的關(guān)系已經(jīng)爭論了半個(gè)世紀(jì)。絕經(jīng)前女性冠心病(CHD)的發(fā)病率僅為男性的1/10至3/10，隨著年齡增長，女性CHD發(fā)病率增高，55～70歲漸達(dá)高峰，以致兩性患者CHD發(fā)生率的差異趨于縮小。絕經(jīng)后女性采用雌激素替代療法，冠脈事件可減少30%～40%。雌激素可能通過影響脂質(zhì)代謝、糖代謝、血壓等方面起到保護(hù)心血管的作用，但并不能全面深入地解釋其對(duì)心血管的保護(hù)機(jī)制。既往臨床試驗(yàn)提示口服一氧化氮(NO)前體L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)對(duì)冠心病患者、高脂血癥患者、健康老年人、青年吸煙者的內(nèi)皮功能可以產(chǎn)生影響?？诜﨤Arg是否可改善內(nèi)皮功能，尚存爭議。本研究選用2種干預(yù)因素雌激素、L-Arg來探討其對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響。從NO、動(dòng)脈內(nèi)皮組織病理變化等角度來探討不同干預(yù)因素的作用，從而為臨床探索絕經(jīng)后安全有效的預(yù)防保健措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與分組 3月齡雌性Wistar大鼠40只(購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)，平均體質(zhì)量為(214.83±10.72)g，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)期間普通飼料飼養(yǎng)，每日光照12 h。隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、雙側(cè)卵巢切除組(B組)、雙側(cè)卵巢切除＋苯甲酸雌二醇(E2)治療組(C組)、雙側(cè)卵巢切除＋E2＋L-Arg治療組(D組)，每組10只。實(shí)驗(yàn)前大鼠E2的含量分別為:A組為(38.66 ±3.89)pg/ml、B 組(37.88 ±2.96)pg/ml、C 組(39.39 ± 2.29)pg/ml、D 組(38.89 ± 3.32)pg/ml，各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。動(dòng)物去勢(shì):10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.3 ml/kg，于無菌條件下在背部正中切開，進(jìn)入腹腔在腎下極附近找到卵巢，用4號(hào)絲線結(jié)扎并摘除雙側(cè)卵巢，分層縫合切口。A組僅找到卵巢后即關(guān)腹分層縫合切口。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素80萬U肌注預(yù)防感染。術(shù)后第3天起連續(xù)4 d經(jīng)陰道做細(xì)胞涂片，無角化者證實(shí)雙側(cè)卵巢切除完全，否則棄去不用。術(shù)后1周根據(jù)組別給予不同的干預(yù)措施，連續(xù)4月。動(dòng)物給藥:A組:每3 d肌注，生理鹽水0.04 ml;B組:每3 d肌注，生理鹽水0.04 ml;C組:E210 μg/d，每 3 d 肌注;D 組:E210 μg/d，每 3 d 肌注，每天2.25%L-Arg飲水。

1.2 標(biāo)本取材 術(shù)后4月，用注射器心臟取血3 ml左右，3000 r/min，15 min，取上層血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜粝滦刂鲃?dòng)脈約3 cm，立即用10%中性福爾馬林固定。

1.3 血清E2、NO、L-Arg濃度的測(cè)定 采用北京北方生物技術(shù)研究所提供的E2放射免疫分析試劑盒測(cè)定各組大鼠血清E2含量;采用南京建成生物工程研究所提供的硝酸還原酶法NO試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清NO含量，按試劑盒操作說明檢測(cè)。L-Arg采用高效液相色譜法測(cè)定(Agilent1100、美國安捷倫公司)［1］。

1.4 主動(dòng)脈組織切片觀察 從10%中性福爾馬林液中取出浸泡的胸主動(dòng)脈，常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm厚)，并將切片行HE常規(guī)染色，于顯微鏡下觀察內(nèi)膜厚度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本均數(shù)的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間D組因麻醉意外死亡1只。其余各組存活良好，未見異常反應(yīng)。

2.1 4月后各組E2、L-Arg、NO水平比較 B組E2和A組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明大鼠去勢(shì)成功。C組E2和A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明大鼠去勢(shì)后適當(dāng)補(bǔ)充E2后可使體內(nèi)E2水平增加，并可以接近未去勢(shì)大鼠的E2水平。D組E2和C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明補(bǔ)充外源性L-Arg對(duì)血清E2水平?jīng)]有影響。

B組L-Arg濃度和A組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明去卵巢并不影響血清L-Arg水平。B組L-Arg和C組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明補(bǔ)充雌激素對(duì)血清L-Arg水平?jīng)]有影響。D組L-Arg水平和C組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明補(bǔ)充外源性L-Arg增加了血清L-Arg水平。

B組NO濃度和A組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示去卵巢顯著降低了大鼠血清NO水平。A組NO和C組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明補(bǔ)充E2后血清NO增加至假手術(shù)組水平。D組NO濃度和C組比較顯著升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明補(bǔ)充L-Arg可以顯著增加血清NO水平。見表1。

表1 各組E2、L-Arg、NO比較(±s)

表1 各組E2、L-Arg、NO比較(±s)

注:與其他3組比較，*P＜0.05;與C組比較，△P＜0.05

組別 n E2(pg/ml) L-Arg(μmol/L)NO(μmol/L)A組10 42.33±2.77 48.50±2.55 42.87±3.74 B組 10 10.43±2.31* 47.90±3.67 30.19±3.02*C組 10 41.03±3.39 48.00±3.02 40.89±3.07 D組 9 43.50±4.34 92.75±10.09△ 47.05±2.34△

2.2 胸主動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)觀察 3月齡大鼠胸主動(dòng)脈HE染色后在光鏡下觀察:A組、C組、D組、胸主動(dòng)脈壁層次清晰，內(nèi)膜薄，中層平滑肌層均勻無萎縮，厚度正常，各組之間未見明顯差異;B組和以上各組相比，內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞不完整，未見明顯脂質(zhì)沉積(圖1)。

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察(×400)

3 討論

1980年Furchgott和Zawadski發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮依賴性舒張現(xiàn)象，提出了內(nèi)皮依賴性舒張因子(endothelium derived relaxing factors，EDRF)的概念，1987年P(guān)almer證實(shí)NO與EDRF具有相同的化學(xué)性質(zhì)，現(xiàn)已知EDRF即為NO。NO是內(nèi)皮細(xì)胞合成的最重要的血管活性物質(zhì)，它不但有強(qiáng)大的擴(kuò)張血管作用，而且有抑制血小板聚集、平滑肌細(xì)胞增生、單核細(xì)胞黏附和黏附分子表達(dá)的作用，從而可防止血管壁發(fā)生粥樣硬化和血栓形成。

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)卵巢切除的大鼠模擬絕經(jīng)模型 卵巢切除后血清E2濃度顯著降低，反映了人工絕經(jīng)后的狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血清NO與E2水平呈正相關(guān):去勢(shì)大鼠隨著E2水平的下降，血清NO水平明顯降低，明顯低于未切除卵巢大鼠(A組);去卵巢大鼠接受E2治療后，血清NO水平升高接近未切除卵巢組，這和以前的眾多文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［2-4］。補(bǔ)充E2使血清NO水平升高提示E2可能通過NO途徑產(chǎn)生心血管保護(hù)效應(yīng)。另外，發(fā)現(xiàn)3月齡A組、C組之間主動(dòng)脈內(nèi)膜形態(tài)學(xué)未見明顯差異，而B組和A組比較內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞不完整。C、D組之間主動(dòng)脈內(nèi)膜病變未見明顯差異。E2能增加NO合成或釋放的機(jī)制還不十分清楚。目前大家公認(rèn)的有:(1)“基因組效應(yīng)”機(jī)制［5］，即經(jīng)典機(jī)制。E2與胞質(zhì)受體結(jié)合，形成激素受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而與核內(nèi)受體結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)榧に?核受體復(fù)合物，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。此種機(jī)制發(fā)揮作用通常需要數(shù)小時(shí)。(2)“非基因組效應(yīng)”機(jī)制［6-8］，即快速信號(hào)通路:E2通過位于細(xì)胞膜上或者毗鄰細(xì)胞膜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者其他相關(guān)的雌激素結(jié)合蛋白，引起細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)而發(fā)揮效應(yīng)。此種機(jī)制發(fā)揮作用只需幾秒或幾分時(shí)間。此外還有雌激素-磷酸肌醇-3激酶-絲氨酸-蘇氨酸—內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路［9］。E2的應(yīng)用可改善全身及局部癥狀的作用已被確定［10］，有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用E2可降低絕經(jīng)后婦女的骨轉(zhuǎn)移率［11］。

3.2 藥理研究發(fā)現(xiàn) L-Arg是NO的生理性前提，在體內(nèi)L-Arg和氧分子在NOS催化下生成NO和L-瓜氨酸而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［12］。最近，L-Arg對(duì)血管內(nèi)皮作用的研究正日益受到科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。人們對(duì)L-Arg寄予厚望，以期能以之改善內(nèi)皮功能，預(yù)防及治療心血管疾病。Boger等［13］對(duì)L-Arg-NO途徑進(jìn)行了較多的研究，他們將雄性家兔分為普通喂飼組、高脂喂飼組、高脂喂飼加L-Arg組，喂飼12周，以尿硝酸鹽濃度表示體內(nèi)NO的水平，結(jié)果顯示L-Arg組尿硝酸鹽濃度增加。本實(shí)驗(yàn)比較各組血清水平的結(jié)果表明:去勢(shì)或絕經(jīng)后血清NO低水平存在，提示絕經(jīng)后提高NO水平的必要性;去卵巢大鼠接受E2治療后，血清NO水平升高接近未切除卵巢組;補(bǔ)充外源性L-Arg亦可明顯提高血清NO水平，此為外源性L-Arg作為體內(nèi)NO供體的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。L-Arg的功效依賴于最初的內(nèi)皮健康狀況。也就是說，基線血流介導(dǎo)的血管舒張?jiān)降?，L-Arg改善內(nèi)皮功能的作用越顯著。LArg改善內(nèi)皮功能的作用機(jī)制可能與增加NO釋放，抑制血小板活化，血栓形成和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)。

目前許多學(xué)者對(duì)正常人、高膽固醇患者及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中L-Arg濃度的報(bào)道各異。Post等［14］對(duì)65名健康的絕經(jīng)后婦女進(jìn)行了雌激素替代及安慰劑對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素治療組血清精氨酸濃度與對(duì)照組相比降低(P=0.05);Verhoeven等［15］對(duì)152名健康絕經(jīng)婦女進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示雌激素治療組血清精氨酸濃度較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，同時(shí)以上實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌激素治療組血清ADMA(內(nèi)源性NOS抑制劑)顯著降低。由于2個(gè)實(shí)驗(yàn)均未測(cè)NO濃度，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者推測(cè)雌激素治療組L-Arg濃度降低是由于雌激素降低了ADMA對(duì)NOS的抑制作用，致使L-Arg生成NO消耗增多所致。Xiong等［16］比較了6月齡及20月齡雄性SD大鼠的血清L-Arg濃度結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)A、B、C組間L-Arg濃度未發(fā)現(xiàn)明顯差異，L-Arg濃度是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異尚需進(jìn)一步大樣本實(shí)驗(yàn)研究。

L-Arg是生成NO的前體，L-Arg來源不足、轉(zhuǎn)運(yùn)障礙或代謝異常都可影響NO的生成，應(yīng)該指出的是，在體內(nèi)L-Arg易被肝臟攝取而進(jìn)入鳥氨酸循環(huán)。因此，合成可選擇性地易被內(nèi)皮細(xì)胞攝取的、高效和長效的L-Arg衍生物，將有助于L-Arg在心血管疾病治療中的廣泛、有效的應(yīng)用。

［1］Mao HM，Wei W，Xiong WJ，et al.Simultaneous determination of l-citrulline and l-arginine in plasma by high performance liquid chromatography［J］.Clin Biochem，2010，43(13-14):1141-1147.

［2］阮云軍，朱小虎，吳賽珠，等.雌激素替代治療去卵巢大鼠血清一氧化氮含量的變化［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2001，9(3):186-188.

［3］金香蘭，姚蘭春，焦?jié)櫳?雌二醇對(duì)去卵巢大鼠心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響［J］.中國醫(yī)療前沿，2009，20(4):3-4.

［4］LeBlanc AJ，Reyes R，Kang LS，et al.Estrogen replacement restores flow-induced vasodilation in coronary arterioles of aged and ovariectomized rats［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，297(6):R1713-R1723.

［5］陸靜，張麗容，劉乃豐.雌激素促血管內(nèi)皮生成一氧化氮的機(jī)制［J］.國外醫(yī)學(xué)心血管疾病分冊(cè)，2002，29(2):76-78.

［6］Chen Z，Yuhanna IS，Galcheva Z，et al.Estrogen receptor alpha mediates the nongenomic activation of endothelial nitric oxide synthase by estrogen ［J］.Clin Invest，1999，103(3):401-406.

［7］Stefano GB，Prevo V，Beauvillain JC，et al.Cell-surface estrogen receptors mediate calcium-dependent nitric oxide release in human endothelia ［J］.Circulation，2000，101(13):1594-1597.

［8］Shaul PW.Novel role of estrogen receptors in vascular endothelium ［J］.Semin Perinatol，2000，24(1):70-74.

［9］Alexaki VI，Charalampopoulos I，Kampa M，et al.Estrogen exerts neuroprotective effects via membrane estrogen receptors and rapid Akt/NOS activation［J］.FASEB，2004，18(13):1594-1596.

［10］薛秀珍.陰道用雌激素治療老年婦女反復(fù)尿路感染［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2003，17(4):221-223.

［11］鄧廉夫.骨質(zhì)疏松的雌激素藥物治療與降低其不良反應(yīng)的對(duì)策［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2008，22(6):413-420.

［12］Meininger CJ，Marinos RS，Hatakeyama K，et al.Impaired nitric oxide production in coronary endothelial cells of the pontaneously diabetic BB rat is due to tetrahydrobioperin deficiency［J］.Biochem，2000，349(Pt 1):353-356.

［13］Boger RH，Bode-Boger SM，Mugge A，et al.Supplementation of hyercholesterolaemic rabbits with L-Arg reduces the vascular release of superoxide anions and restores NO production［J］.Atherosclerosis，1995，117(2):273-284.

［14］Post MS，Verhoeven MO，van der Mooren MJ，et al.Effect of hormone replacement therapy on plasma levels of the cardiovascular risk factor asymmetric dimethylarginine:a randomized，placebo-controlled 12-week study in healthy early postmenopausal women［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88(9):4221-4226.

［15］Verhoeven MO，Hemelaar M，van der Mooren MJ，et al.O-ral，more than transdermal，oestrogen therapy lowers asymmetric dimethylarginine in healthy postmenopausal women:a randomized，placebo-controlled study［J］.J Intern Med，2006，259(2):199-208.

［16］Xiong Y，Yuan LW，Deng HW，et al.Elevated serum endogenous inhibitor of nitric oxide synthase and endothelial dysfunction in aged rats［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2001，28(10):842-847.