李慧 趙璨 張華 張曉光 歐陽(yáng)溪 馮美江

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種以黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元減少為主要病理特征的慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前臨床上主要通過(guò)藥物或手術(shù)控制癥狀，但并不能阻斷PD的病理生理進(jìn)程，所以仍需尋找針對(duì)PD病因的治療方法［1-2］。近年來(lái)研究證實(shí)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)能被誘導(dǎo)分化為多巴胺(DA)能神經(jīng)元，移植入PD模型鼠后癥狀改善，且中腦酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)表達(dá)量增加，因此可以作為PD的理想治療方案。此外，越來(lái)越多的研究表明，分泌腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可能是干細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制之一［3-4］。本研究嘗試將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元(dopam-inergic neurons)并對(duì)其鑒定，進(jìn)一步觀察細(xì)胞中BDNF的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 材料 熒光二抗(購(gòu)自武漢博士德公司)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、音猥因子 (SHH)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)(購(gòu)自RD公司)，Tryple酶和N2因子(購(gòu)自GIBCO公司)，維生素C(Vit-C)和抗-TH抗體(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，抗-BDNF抗體和抗-β-微管蛋白Ⅲ抗體(購(gòu)自 abcam公司)，抗-神經(jīng)元核抗原(NeuN)抗體(購(gòu)自北京中杉金橋公司)，DAPI(購(gòu)自碧云天公司)，倒置熒光顯微鏡(為Olympus公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 臍帶MSCs的分離培養(yǎng):本實(shí)驗(yàn)遵照倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)家有關(guān)規(guī)范。在無(wú)菌條件下收集足月產(chǎn)健康新生兒臍帶，用生理鹽水充分沖洗并剔除臍動(dòng)、靜脈，剝離出華通氏膠后將其剪碎至1 mm3大小，接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，置37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。16 d時(shí)用Tryple酶消化，見(jiàn)胞質(zhì)回縮時(shí)加入DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)終止消化，將細(xì)胞懸液放入離心管內(nèi)，800 r/min離心8 min，生理鹽水洗滌2次，原代以1∶2的比例進(jìn)行再次接種培養(yǎng)，記為P1代。P2代以后按1∶2或1∶3的比例傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.2 誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元:將P3代臍帶MSCs以1×104個(gè)/孔密度接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后更換神經(jīng)誘導(dǎo)液［DMEM/F12、50 μg/ml Vitc、250 ng/ml SHH、100 ng/ml FGF8、50 ng/ml bFGF、N2(100×)］。誘導(dǎo)9 d后，再往誘導(dǎo)液中加入50 ng/ml的BDNF(加入BDNF時(shí)，24孔板中的誘導(dǎo)液不換)，繼續(xù)誘導(dǎo)3 d，每天觀察，拍照，未誘導(dǎo)的臍帶MSCs作為對(duì)照。

1.2.3 誘導(dǎo)后細(xì)胞凍存、復(fù)蘇與存活率檢測(cè):凍存時(shí)，采集誘導(dǎo)后細(xì)胞加入含10%二甲基亞砜(DMSO)的細(xì)胞凍存液，混勻后轉(zhuǎn)入凍存管，放入4℃預(yù)冷程序降溫盒，-80℃冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮中保存。復(fù)蘇時(shí)，取出細(xì)胞凍存管立即放入37℃水浴箱，輕度搖動(dòng)令其快速融化，將融化的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入含生理鹽水的離心管中，離心去上清。取部分復(fù)蘇細(xì)胞檢測(cè)存活率:將細(xì)胞與臺(tái)盼藍(lán)混勻，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)＋死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)β-微管蛋白Ⅲ、NeuN、TH、BDNF蛋白表達(dá):將P3代臍帶MSCs以8×103/cm2的密度接種入鋪有蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)24 h。采用上述神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)12 d后開(kāi)始進(jìn)行免疫熒光染色鑒定;已誘導(dǎo)的凍存細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，在鋪有蓋玻片的6孔板中貼壁生長(zhǎng)后即可進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次，每次3 min。加入含有0.1%TritonX-100的山羊血清室溫孵育30 min后，分別與β-微管蛋白Ⅲ抗體(稀釋濃度為1∶500)/TH(1∶1000)/NeuN(1∶100)/BDNF(1∶1500)孵育過(guò)夜;行熒光雙標(biāo)時(shí)與一抗混合液孵育過(guò)夜:鼠抗-TH和兔抗-BDNF/兔抗-TH和鼠抗β-微管蛋白Ⅲ;加入 DAPI(稀釋濃度為1∶500)及相應(yīng)二抗孵育120 min。熒光倒置顯微鏡觀察。隨機(jī)抽取3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞陽(yáng)性率計(jì)數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各實(shí)驗(yàn)組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臍帶MSCs誘導(dǎo)前后形態(tài)學(xué)觀察 傳代培養(yǎng)2～3代后，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)較為一致，為細(xì)長(zhǎng)梭形細(xì)胞，呈克隆樣生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

2.2 UCMSCs誘導(dǎo)后分化為多巴胺能樣神經(jīng)元

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察:經(jīng)誘導(dǎo)分化后可見(jiàn)細(xì)胞胞體變大，逐漸伸出突起并伸長(zhǎng)，表現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。見(jiàn)圖1。

圖1 臍帶MSCs誘導(dǎo)前后形態(tài)學(xué)觀察(×200)

2.2.2 免疫熒光鑒定神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白:對(duì)照組免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，未誘導(dǎo)的MSCs可表達(dá)β-微管蛋白Ⅲ，陽(yáng)性率為(21.24±0.97)%，但NeuN、TH和BDNF均無(wú)表達(dá)。誘導(dǎo)組免疫熒光檢測(cè)DA能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志，TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率為(17.65±1.91)%;神經(jīng)元標(biāo)記物β-微管蛋白Ⅲ及NeuN陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為(55.54±11.67)%和(70.00±7.52)%，均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。用免疫熒光分別檢測(cè)2組細(xì)胞內(nèi)BDNF表達(dá)情況，對(duì)照組中無(wú)BDNF表達(dá)，而誘導(dǎo)組細(xì)胞中可見(jiàn)BDNF表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞比率為(14.15±3.04)%。復(fù)蘇后的誘導(dǎo)細(xì)胞仍可穩(wěn)定檢測(cè)到β-微管蛋白Ⅲ、TH和NeuN的表達(dá)(圖 2，3)。

2.2.3 已誘導(dǎo)細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞存活率檢測(cè):細(xì)胞存活率為(92.5±1.83)%，復(fù)蘇后狀態(tài)良好，可在培養(yǎng)劑中正常生長(zhǎng)。

3 討論

PD患病率在＞60歲老年人神經(jīng)退行性疾病中位居第二，僅次于阿爾茨海默病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)異常。中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性、缺失和死亡是PD的主要病理改變。但是，目前的常規(guī)治療(包括內(nèi)科及外科治療)僅能控制癥狀，并不能延緩、阻止PD病理的進(jìn)展［1-2］。所以尋找針對(duì)PD的病因治療手段已成為當(dāng)前該領(lǐng)域臨床研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，能在體內(nèi)存活，分泌細(xì)胞因子，并替代死亡或者衰老的細(xì)胞。此外，干細(xì)胞源性DA能神經(jīng)元行移植治療還可補(bǔ)充腦內(nèi)TH的不足，促進(jìn)腦內(nèi)DA的合成，因此，目前認(rèn)為PD是最適合進(jìn)行細(xì)胞替代治療(cell replacement therapy，CRT)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。目前認(rèn)為，多種類(lèi)型的干細(xì)胞都可向DA能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化，但臍帶MSCs有明顯的優(yōu)越性，其來(lái)源廣泛、易培養(yǎng)、免疫源性小、無(wú)倫理道德?tīng)?zhēng)議及移植后能夠長(zhǎng)期存活，從而決定其可作為一種優(yōu)秀的種子細(xì)胞［6］。

本實(shí)驗(yàn)采用臍帶MSCs行兩步誘導(dǎo)法，首先應(yīng)用SHH、FGF8、bFGF等特定細(xì)胞因子使其誘導(dǎo)分化形成成熟的神經(jīng)元，分化比例約為70%，并可明顯表達(dá)β-微管蛋白Ⅲ及NeuN等神經(jīng)元特異性標(biāo)志物;再應(yīng)用BDNF使其定向誘導(dǎo)分化形成多DA神經(jīng)元，比例約為17.65%，并可明顯表達(dá)特異性TH，誘導(dǎo)效率良好。誘導(dǎo)細(xì)胞可通過(guò)低溫保存，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率高達(dá)(92.5±1.83)%，且能夠穩(wěn)定表達(dá)TH、β-微管蛋白 Ⅲ和NeuN。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了誘導(dǎo)前后細(xì)胞中BDNF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前無(wú)BDNF表達(dá)，而誘導(dǎo)后細(xì)胞中可見(jiàn)明顯BDNF表達(dá)，且BDNF與TH共定位。大量研究表明，BDNF對(duì)DA能神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)、促分化和保護(hù)作用，應(yīng)用反義核酸阻斷BDNF表達(dá)可導(dǎo)致黑質(zhì)內(nèi)DA能神經(jīng)元缺失［7-8］，提示 BDNF可能與 PD的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)證明，在PD模型鼠黑質(zhì)內(nèi)行人MSCs移植治療后，腦內(nèi)BDNF含量明顯增高［9］。另外，在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞替代治療研究中發(fā)現(xiàn)BDNF與干細(xì)胞移植聯(lián)合治療效果優(yōu)于單純干細(xì)胞移植治療［10］。目前普遍認(rèn)同膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)在干細(xì)胞治療PD時(shí)發(fā)揮了一定的作用，而近期的研究表明，在PD小鼠模型中，GDNF對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用可能是通過(guò)上調(diào)Pitx3介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)BDNF合成而實(shí)現(xiàn)的［11］。上述研究均提示，BDNF能提高干細(xì)胞移植的療效并且可能是該療法的作用機(jī)制之一。我們對(duì)比了誘導(dǎo)前后細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)，HUCMSCs無(wú)表達(dá)，而誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)比率為(14.15±3.04)%。該結(jié)果提示，誘導(dǎo)后含部分DA能神經(jīng)元的細(xì)胞可能較HUCMSCs更適合PD的細(xì)胞替代治療。

綜上所述，臍帶MSCs經(jīng)特定的誘導(dǎo)劑作用后可部分定向分化為PA能神經(jīng)元，此類(lèi)DA能神經(jīng)元內(nèi)不僅能有效表達(dá)TH，還可表達(dá)BDNF，因此不僅有可能補(bǔ)充腦內(nèi)DA的生成不足，還可能發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果可能為今后應(yīng)用此類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行PD的細(xì)胞替代治療提供一定的理論基礎(chǔ)。然而，PD細(xì)胞替代治療的療效不僅取決于干細(xì)胞供體，可能還與其體內(nèi)存活率、分化潛能以及微環(huán)境與干細(xì)胞的相互影響等因素有關(guān)。所以，仍需在今后的在體實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步觀察，以明確此類(lèi)來(lái)源于HUCMSCs的DA能神經(jīng)元在PD細(xì)胞替代治療中的真正作用。

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