李海波 劉敏娟 毛君 李紅 陳瑛

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 生殖與遺傳中心，江蘇 蘇州 215002）

脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是 X連鎖顯性遺傳病［MIM：300624］，F(xiàn)MR1基因中（CGG）n重復(fù)序列的不穩(wěn)定性擴展及其上游Cp G島的異常甲基化是導(dǎo)致該病的分子基礎(chǔ)。臨床表現(xiàn)以不同程度的智力障礙為主，此外可伴有行為和體格發(fā)育異常及卵巢早衰等。在正常人群中其攜帶者所占比例高達1%［1］，目前尚無確切的藥物可以治療，女性攜帶者不但可累及生殖系統(tǒng)，還會將生育后代的致病效應(yīng)放大，使子女出現(xiàn)嚴重的智力及生理功能異常，因此對孕婦行產(chǎn)前篩查進而指導(dǎo)生育就顯得尤為重要［2］。

因FMR1基因序列的特殊性，傳統(tǒng)的PCR或PCR聯(lián)合Southern Blot等技術(shù)或難于擴增，或檢測精度不夠，本文旨在建立基于熒光PCR快速篩查技術(shù)，分析普通孕婦人群中的FMR1基因（CGG）n序列重復(fù)次數(shù)，并評估對其產(chǎn)前基因篩查的臨床應(yīng)用價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象 2009～2010年間在蘇州市立醫(yī)院持母嬰陽光工程基因篩查券進行孕中期產(chǎn)前篩查的孕婦356名，均簽署知情同意書。有3例明確CGG重復(fù)數(shù)的女性攜帶者樣本用于技術(shù)體系的驗證檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA制備 每例取200μl外周血，利用QIAamp DNA Mini Blood Kit（Qiagen公司，德國）提取基因組DNA，應(yīng)用 NanoDrop-1000（Thermo公司，美國）檢測其濃度和純度后，稀釋至20 ng／μl。

1.2.2 熒光PCR 參考Coffee等［3］報導(dǎo)的方法加以改進，正反向引物跨越CGG重復(fù)區(qū)及側(cè)翼序列，引 物 序 列 為：FXFOR 5′-AGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCCTTC-3′（正 向）和 FXX3 5′-FAM-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3′（反向）（捷瑞生物工程有限公司，上海）。PCR總反應(yīng)體系15μl，試劑主要購自瑞士Roche公司：去離子水4.83μl，10×PCR fasttaq buffer 1.0μl，5×RICH buffer 0.08μl，DMSO 0.5μl，25m M MgCl2溶液0.6μl，10m M 含有等比例d NTP和deaza d GTP 1.6μl，4 m M 引物FXFOR、FXX3各0.2μl，F(xiàn)aststart Taq聚合酶0.6μl，模板DNA為0.6μl。反應(yīng)于熱循環(huán)儀上進行 （9700型，ABI公司，美國）。反應(yīng)起始溫度98℃ 變性5分鐘；共10個循環(huán)中97℃變性35秒，62℃復(fù)性35秒，72℃延伸3分鐘；接著20個循環(huán)，97℃變性35秒，62℃復(fù)性35秒，72℃延伸4分鐘，每循環(huán)延伸時間增加20秒；72℃延伸10分鐘。

1.2.3 毛細管電泳分析 每反應(yīng)體系中加入Hi-Di甲酰胺（ABI公司，美國）9.0μl，內(nèi)標ROX-1000（ABI公司，美國）0.2μl，熒光PCR產(chǎn)物1.0μl，混勻離心后，95℃變性5分鐘，立即置冰上5分鐘。采用ABI 3130遺傳分析儀進行毛細管電泳，應(yīng)用GeneMaper V3.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)電泳峰位置坐標計算CGG重復(fù)次數(shù)，公式為（CGG）n＝（橫坐標位置-151）／3＋漂移系數(shù)。

2 結(jié) 果

參考Coffee等［3］的電泳峰圖判讀標準，在356例孕婦中，275例（77.25%）毛細管電泳結(jié)果顯示為2組峰，提示為雜合型基因型，可以明確診斷，且2組峰計算后（CGG）n重復(fù)數(shù)均低于130個重復(fù)。雜合基因型等位基因分布范圍見圖1所示，CGG重復(fù)數(shù)主要分布在29～35之間，占69.44%。275例樣本中（CGG）重復(fù)大于45的前突變攜帶者共6例（2.18%）。

圖1 CGG重復(fù)數(shù)的人群分布柱狀圖

81例（22.75%）僅見到一組峰，提示可能是純合子，也可能存在一組峰（CGG）n重復(fù)數(shù)高于130而超出本方法檢測范圍之外，這部分顯示單組峰的樣本也可能是前突變或全突變攜帶者（圖2）。

圖2 不同基因型毛細管電泳峰型圖

3例已知CGG重復(fù)數(shù)樣本的驗證檢測中，1例正常、1例CGG重復(fù)數(shù)115的攜帶者均能夠正確檢出，1例CGG重復(fù)數(shù)為350的攜帶者未能明確檢出。

3 討 論

1991年P(guān)ieretti等［4］發(fā)現(xiàn)了FXS相關(guān)致病基因FMR1，提出FMR1基因內(nèi)（CGG）n重復(fù)序列的不穩(wěn)定性擴展及其上游Cp G島的異常甲基化是導(dǎo)致該病的分子基礎(chǔ)。研究指出小于44個CGG重復(fù)為正常；45～54個CGG重復(fù)為中間型（灰區(qū)）；55～200個CGG重復(fù)屬于前突變型；大于200個CGG重復(fù)為突變型，為致病型。前突變型未表現(xiàn)臨床癥狀，但約有20%的前突變型女性攜帶者易發(fā)生“脆性X原發(fā)性卵巢功能不全（FX-POI）”，而部分前突變型男性攜帶者在其老年時期易發(fā)生“脆性X相關(guān)震顫-共濟失調(diào)綜合征（FX-TAS）”。全突變型的男性100%表現(xiàn)臨床癥狀，女性則依據(jù)X染色體失活的不同而具有異質(zhì)性臨床癥狀。

前突變攜帶者的后代會增加約100個CGG的重復(fù)，這樣子代變成致病性全突變的幾率近100%。經(jīng)過大樣本的檢測分析［5］和人群調(diào)研［6］，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)協(xié)會（ACMG）、世界衛(wèi)生組織（WHO）已公布出進行FXS分子診斷的適宜人群，并確立了診療指南［7，8］，以色列等國家已在孕婦中進行常規(guī)篩查［9］。我國FMR1前突變的篩查未被廣泛接受的主要原因為檢測技術(shù)水平的限制及缺少區(qū)域人群突變攜帶率的有效數(shù)據(jù)，本研究也旨在揭示蘇州地區(qū)脆性X攜帶者的突變譜及頻率，初步結(jié)果顯示CGG重復(fù)數(shù)低于130個重復(fù)的樣本前突變攜帶率即達2.18%，高于以往報道［1］，提示蘇州地區(qū)產(chǎn)前FXS產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查的可行性。

現(xiàn)有多種方法用于FXS的分子診斷，其中包括Southern印跡雜交法，按照雜交出的條帶結(jié)果可檢出全部前突變和全突變等位基因，還可檢測CpG島的甲基化，是目前較為可靠的診斷方法。但是該方法的缺點是酶解不完全，容易造成假陽性結(jié)果，操作繁瑣，花費高，對樣本量要求大，難于精確確定拷貝數(shù)等。在基因表達水平上的檢測方法有RT-PCR方法（檢測FMR1基因的轉(zhuǎn)錄）和免疫學(xué)方法（采用抗體檢測FMR1基因的翻譯產(chǎn)物FMRP蛋白），但只能檢測全突變患者，所以很難將其應(yīng)用于大范圍的人群篩查。本實驗方法與上述方法相比，具有高通量、簡便、快速、價廉的特點，初篩能夠快速排除近80%的雜合的正常個體及重復(fù)數(shù)在50～130個重復(fù)的前突變個體。剩余病例的明確診斷尚需其他與本技術(shù)檢測手段類似的技術(shù)（如AmplideX FMR1 PCR Kit，Asuragen公司，美國）加以輔助［10］。通過本研究，我們認為本方法可靠、簡便，對產(chǎn)前孕婦FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)篩查具有一定的臨床應(yīng)用價值。

致謝感謝北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系鐘南教授對本研究的指導(dǎo)。

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