李莉 王殿華 張旋 宋鑫 馬曉骉 胡早秀

肺纖維化（pulmonary fibrosis, PF）是肺的炎癥改變及纖維重塑同時(shí)存在的一種疾病。在肺癌的放化療過程中，如博來霉素（bleomycin, BLM）的應(yīng)用常?？梢詫?dǎo)致非特異性肺炎和肺纖維化[1,2]。氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中的藥物濃度與肺纖維化疾病療效密切相關(guān)，肺泡和支氣管上皮就成了藥物運(yùn)輸和治療的主要靶標(biāo)[3]。因此，如何將高濃度的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到肺部是治療肺纖維化疾病的關(guān)鍵。

肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（peptide transporter 2, PEPT2）定位于支氣管上皮細(xì)胞、II型肺泡上皮細(xì)胞和小血管的內(nèi)皮細(xì)胞中，可以通過底物轉(zhuǎn)位與作為驅(qū)動(dòng)力的跨膜電化學(xué)質(zhì)子梯度相偶聯(lián)，轉(zhuǎn)運(yùn)肽和肽類藥物。轉(zhuǎn)運(yùn)效率較高，并可以降低給藥劑量，減少全身副反應(yīng)的發(fā)生[4,5]。目前，肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體已經(jīng)成為合理設(shè)計(jì)肽和肽類藥物如抗腫瘤、抗生素及抗病毒藥物的靶標(biāo)。因此，研究PEPT2在治療肺疾病中的作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠50只（200 g±20 g），雌雄各半，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；博萊霉素（日本化藥株式會(huì)社）；羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型復(fù)制 50大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。正常對(duì)照組不作任何處理；生理鹽水組：氣管內(nèi)一次性滴入0.2 mL生理鹽水，14 d后予股動(dòng)脈放血處死；博萊霉素7 d、14 d、28 d組：氣管內(nèi)一次性滴入0.5%的BLM溶液5 mg·kg-1，復(fù)制肺纖維化模型，分別于給藥后7 d、14 d和28 d予股動(dòng)脈放血處死取肺組織。

1.2.2 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 股動(dòng)脈放血處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，開胸取右肺下葉，用10%中性甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色和GS染色后光鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 肺組織中羥脯氨酸（hydroxyproline, HYP）含量測(cè)定采用堿水解法測(cè)定大鼠肺組織中HYP的含量，反映肺纖維化的程度。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) 取肺組織樣品100 mg，將組織剪碎，加入1 mL Trizol。用勻漿器充分勻漿，用氯仿、異丙醇、75%乙醇提取肺組織總RNA。采用第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，PEPT2序列5'-GCTGCCTACTGAAGCCAAATGCTTG-3'及5'-AGAGGCTGCTGAAGGCATGGT-3'；內(nèi)參照采用GAPDH，引物序列為5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'及5'-TTTGAGGGTACAGCGAACTT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為327 bp。PCR反應(yīng)：模板濃度為60 pg，94oC變性1 min，55oC退火1 min，72oC延伸1 min，擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，72oC延伸10 min。

1.2.5 RT-PCR產(chǎn)物半定量測(cè)定 由上海生工生物有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序，使用FASTA與基因庫中大鼠PEPT2序列進(jìn)行同源性比較；用GelDoc凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，并用Quantity One軟件對(duì)各陽性條帶的光密度進(jìn)行測(cè)定，以PEPT2與GAPDH的光密度比值表示PEPT2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，結(jié)果用Mean±SD表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BLM致大鼠肺纖維化組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色光鏡觀察發(fā)現(xiàn)：BLM 7 d組大鼠肺泡腔內(nèi)滲出物增多，局部有少量出血，肺泡壁內(nèi)和肺間質(zhì)內(nèi)有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見少量成纖維細(xì)胞，存在局部萎陷及小血管壁增厚，呈彌漫性肺泡炎改變；BLM 14 d組大鼠部分肺組織呈片狀實(shí)變，肺泡上皮細(xì)胞增生，肺泡壁增寬，片狀肺泡腔縮小或消失，個(gè)別肺泡腔內(nèi)可見泡沫細(xì)胞，肺泡間質(zhì)內(nèi)可見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞增生，腔內(nèi)可見脫落壞死的上皮細(xì)胞；BLM 28 d組大鼠部分肺組織呈片狀實(shí)變，肺泡腔廣泛的縮小或消失，肺泡壁增寬，纖維化；在肺泡間質(zhì)、肺泡腔內(nèi)可見較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張，見圖1。GS染色結(jié)果顯示：BLM 14 d組大鼠肺內(nèi)膠原纖維數(shù)量及分布基本正常，局部網(wǎng)狀纖維大量增生；BLM 28d組大鼠肺內(nèi)大量增生的網(wǎng)狀纖維中出現(xiàn)增生的膠原纖維島，見圖2。

2.2 BLM致肺纖維化大鼠肺組織羥脯氨酸含量的變化BLM致大鼠肺纖維化過程中，大鼠肺組織HYP含量隨時(shí)間增長(zhǎng)逐漸升高，BLM 7 d組肺組織HYP含量與正常對(duì)照組、生理鹽水組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），14 d 組和28 d組大鼠肺組織HYP含量依次增高，且均高于正常對(duì)照組和生理鹽水組（P＜0.05），見圖3。

2.3 半定量 RT-PCR檢測(cè)肺纖維化大鼠肺組織PEPT2 mRNA表達(dá) RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中大鼠PEPT2序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示與GenBank中大鼠PEPT2（基因登錄號(hào)：D63149，gi: 1374711）cDNA序列幾乎完全一致，同源性高達(dá)99.3%（284/286），RT-PCR產(chǎn)物序列（1 bp-284 bp）與大鼠PEPT2 cDNA序列的154 bp-437 bp完全一致。此結(jié)果證實(shí)了RT-PCR產(chǎn)物為大鼠PEPT2 cDNA片段。

各組大鼠肺組織PEPT2和GAPDH凝膠電泳圖，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)可見PEPT2的長(zhǎng)度為327 bp，內(nèi)參GAPDH的長(zhǎng)度為252 bp，見圖4A。測(cè)定PEPT2 mRNA和GAPDH陽性條帶的光密度百分?jǐn)?shù)，以PEPT2與內(nèi)參GAPDH的光密度百分?jǐn)?shù)的比值表示相對(duì)表達(dá)量，各實(shí)驗(yàn)組肺組織PEPT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4B。

圖 1 各組大鼠肺組織的病理改變（HE，×80）。A：對(duì)照組；B：生理鹽水組；C：博來霉素7天組；D：博來霉素14天組；E：博來霉素28天組。Fig 1 Histopathologic changes of lung tissue in each group (HE, ×80). A: control group; B: normal saline solution (NS) group; C: bleomycin (BLM) 7 d group; D: BLM 14 d group; E: BLM 28 d group.

圖 2 生理鹽水組（A）、BLM 14 d（B）和28 d（C）組大鼠肺組織GS染色圖（×80）Fig 2 GS staining of lung tissue of NS (A), BLM 14 d (B) and 28 d (C) groups (×80)

圖 3 各組大鼠肺組織的HYP含量Fig 3 Content of hydroxyproline (HYP) of lung tissue in each group. Vs control group: △P=0.240; ▲P=0.132; *P＜0.001; #P＜0.001.

3 討論

PEPT2屬于H+依賴性寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族（family of proton-dependent oligopeptide transporter, POT），可在肺、腎臟、大腦、脾和乳腺等組織表達(dá)[6,7]。在肺部，PEPT2 mRNA主要在支氣管上皮細(xì)胞、肺泡II型上皮細(xì)胞和小血管的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)[4,5]。PEPT2獨(dú)特的分子特征及其組織分布特點(diǎn)，可以將高濃度的抗生素、抗病毒藥物運(yùn)輸?shù)綒獾郎掀ぜ?xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中[4,5]。據(jù)報(bào)道[4-7]PEPT2可轉(zhuǎn)運(yùn)仿肽類藥物如β-內(nèi)酰胺抗生素、苯丁亮氨酸、腎素抑制劑。因此，肺組織中PEPT2 mRNA的表達(dá)量與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)效率密切相關(guān)。

放射治療是中晚期肺癌綜合治療的重要治療手段之一，且常常引起放射性肺損傷，最終導(dǎo)致肺纖維化[1,2]。廣泛應(yīng)用的化療藥物如博來霉素，使用本藥10%-23%患者可發(fā)生肺毒性，表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、胸痛、肺部啰音等，導(dǎo)致非特異性肺炎和肺纖維化，甚至快速死于肺纖維化[2,8,9]。肺纖維化是一種高致死率疾病，至今尚無有效的治療策略能阻止其自然進(jìn)程和致死性[3]。研究[4,5]表明，氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中的藥物濃度與肺纖維化疾病療效密切相關(guān)。因此，如何將高濃度的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到肺部是治療肺纖維化疾病的關(guān)鍵。研究PEPT2蛋白在肺纖維化大鼠肺組織的表達(dá)，可有效地將治療肺纖維化疾病的新型肽類藥物及前體藥物運(yùn)輸?shù)椒尾浚岣叻谓M織局部的藥物濃度，從而促進(jìn)治療肺纖維化疾病的新型藥物和新的治療策略的發(fā)展。

圖 4 各組大鼠肺組織中PEPT2 mRNA和GAPDH mRNA的變化。A：各組大鼠肺組織中PEPT2 mRNA和GAPDH mRNA的凝膠電泳圖。1：對(duì)照組；2：NC組；3：BLM 7 d組；4：BLM 14 d組；5：BLM 28 d組；B：柱狀圖顯示各組大鼠肺組織中PEPT2 mRNA和GAPDH mRNA光密度比值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.696）。Fig 4 The change of PEPT2 mRNA and GAPDH mRNA of lung tissue in each group. A: Agarose gel electrophoresis of PEPT2 mRNA and GAPDH mRNA of lung tissue in each group.1: control group; 2: NS group; 3: BLM 7 d group; 4: BLM 14 d group; 5: BLM 28 d group; B: Compared the ratio of light density of PEPT2 and GAPDH mRNA which were products of RT-PCR each group in the lung tissue of rat. Vs betweem groups: P=0.696.

1996年，德國(guó)Boll教授[10]首先在腎臟發(fā)現(xiàn)具有高親和力的肽及肽類藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PEPT2，并鑒定其分子結(jié)構(gòu)。1999年Grondberg[11]首次通過Northerning blot和RTPCR技術(shù)研究表明PEPT2可在正常大鼠呼吸道中表達(dá)。隨后開展了針對(duì)正常動(dòng)物肺組織中PEPT2的結(jié)構(gòu)、功能和分子特征的大量研究[4,6,7,12,13]。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)肺部疾病狀態(tài)下PEPT2 mRNA在動(dòng)物肺部表達(dá)水平的研究較少。

動(dòng)物模型是否復(fù)制成功有一定的評(píng)價(jià)指標(biāo)，目前評(píng)價(jià)該模型是否建立，最主要的指標(biāo)是對(duì)肺組織進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)價(jià)，其次還有肺膠原蛋白及纖維蛋白的代謝產(chǎn)物含量的測(cè)定等[9]。本研究在成功復(fù)制的肺纖維化大鼠動(dòng)物模型上，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PEPT2 mRNA在大鼠肺部的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLM各組大鼠肺組織PEPT2 mRNA表達(dá)水平與正常組大鼠和生理鹽水組大鼠相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。這表明PEPT2 mRNA在BLM致肺纖維化大鼠肺組織表達(dá)水平無明顯變化。

PEPT2為高親和力低容量轉(zhuǎn)運(yùn)載體，正常狀態(tài)下可轉(zhuǎn)運(yùn)大量藥理活性底物致肺部，肺部疾病狀態(tài)下，由于PEPT2 mRNA在肺纖維化大鼠肺組織表達(dá)水平無明顯變化，表明在肺纖維化時(shí)，可以通過肺部給藥方式給予肽和肽類藥物，降低藥物的蛋白分解作用和避免肝臟的首過效應(yīng)，使其通過PEPT2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)作用，將高濃度的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到靶位，提高局部的藥物濃度，增加其生物利用度，從而提高藥物療效。本實(shí)驗(yàn)通過研究藥物作用的靶點(diǎn)——肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PEPT2蛋白在肺纖維化狀態(tài)下的表達(dá)情況，可為研制高效低毒的新型肽類藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。