王慧霞 楊梅 張鐵須 陳勝枝

我國處于世界食管癌高發(fā)地帶，死亡率高，目前分子生物學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了食管癌病因?qū)W的研究及靶向治療的進(jìn)展。骨橋蛋白(osteopontin.，OPN)是一種糖基化磷酸化蛋白，具有分泌性、粘附性，在人許多腫瘤中過量表達(dá)。β-連環(huán)蛋白(βcatenin)參與E-cad/cat復(fù)合體的形成，與細(xì)胞粘附有關(guān)，而且在wnt信號傳導(dǎo)通路中與下游多個(gè)因子作用，參與細(xì)胞的增殖和分化。本研究應(yīng)用免疫組化法探討骨橋蛋白及β-連環(huán)蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)與食管鱗癌臨床分期，分化程度，轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以及骨橋蛋白及β-連環(huán)蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性，為食管癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后提供客觀生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 60例標(biāo)本是本院外科2009年1月至2012年7月手術(shù)切除食管癌標(biāo)本(同一病例包括癌組織、距腫瘤上、下緣5 cm以外癌旁正常組織)，HE切片病理證實(shí)為鱗癌。其中男33例，女27例;年齡35～73歲，中位年齡50歲。高分化為34例、中、低分化26例，其中31例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，29例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期29例，Ⅲ+Ⅳ期31例;按浸潤深度分，T1+T225例，T3+T435例。選取60癌旁正常組織例作為對照。

1.2 試劑 濃縮型抗OPN鼠抗人單克隆抗體、β-catenin鼠抗人單克隆抗體及免疫組化試劑盒及DAB試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化(SP法) 取厚4μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化后，采用電爐加熱煮沸修復(fù)抗原，OPN，β-catenin單克隆抗體均按1∶100稀釋，操作參照產(chǎn)品說明書。工作液濃度均為1∶100，以磷酸緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。用已證實(shí)的 OPN、β-catenin染色陽性食管鱗癌切片作陽性對照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定 在光鏡下任意選擇5個(gè)具有代表性的高倍視野，每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞。骨橋蛋白:①陽性標(biāo)準(zhǔn)為:細(xì)胞質(zhì)呈棕黃或棕褐色為陽性細(xì)胞。據(jù)染色程度及陽性細(xì)胞數(shù)來計(jì)算評分:a染色程度:0為陰性，1為弱陽性，2為中等陽性，3為強(qiáng)陽性b陽性細(xì)胞數(shù):無陽性細(xì)胞為0，陽性細(xì)胞1% ～25%為1，陽性細(xì)胞25% ～50%為2，陽性細(xì)胞＞50%為3。a+b為3～6分者評為免疫組織染色陽性。②計(jì)數(shù)方法:結(jié)果判定在雙盲法下進(jìn)行，每張切片由兩名病理醫(yī)師分別判斷。兩者不一致時(shí)重新計(jì)數(shù)。

β-catenin著色于細(xì)胞膜，其染色標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)，將染色強(qiáng)度分為3級:無著色(1級)，淺黃色(2級)，棕黃色(3級);依據(jù)鏡下陽性染色細(xì)胞數(shù)占癌細(xì)胞總數(shù)的百分率綜合判斷，陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為l級，26% ～75%為2級，≥75%的為3級。每張切片的最后得分為2次評分的乘積(1～9)，將1～9分為兩級，＞7為陽性表達(dá)(+)，＜7為陰性表達(dá)(-)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)，以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨橋蛋白，β-catenin在食管鱗癌中的表達(dá) 60例食管鱗癌組織中，48例OPN染色陽性(80.00%)，在食管鱗癌組織中，OPN主要存在于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿中。OPN多彌散表達(dá)于癌巢中，在癌巢邊緣分布較少。在60例癌旁正常組織未見OPN表達(dá)，兩組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。βcatenin在癌旁正常組織中表達(dá)均位于細(xì)胞膜，胞漿未見明顯的陽性信號。癌旁正常組織和癌組織中β-catenin陽性表達(dá)率分別為91.7%(55/60)和65%(39/60)，兩組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)

2.2 OPN及β-catenin的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 骨橋蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、臨床分期、浸潤深度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.271、7.358、15.429，P ＜ 0.05)，與腫瘤分化程度無關(guān)(χ2=2.053，P＞0.05)。β-catenin和分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.204、5.350，P＜0.01)，且和臨床分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.053，P＜0.05)，分化程度越低陽性率越低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，見表1。

表1 骨橋蛋白與β-catenin與病理特征的關(guān)系

2.3 骨橋蛋白和β一catenin在食管癌中表達(dá)的相關(guān)性分析配對資料的Spearman相關(guān)分析顯示，EGFR表達(dá)與β-catenin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(rs=-0.280，P=0.031)，見表2。

表2 骨橋蛋白表達(dá)及β-catenin表達(dá)的相互關(guān)系

3 討論

食管癌預(yù)后之差在于其癌細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖能力及侵襲性，遺傳易感性與暴露的特定環(huán)境相互作用，多基因的遺傳變異均涉及食管癌的發(fā)生和發(fā)展。

OPN含有特異的Arg-Gly-Asp序列(RGD)，通過這個(gè)序列與其生長所需的微環(huán)境-細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合，從而在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用[1]。OPN在鱗狀細(xì)胞癌的分布主要在腫瘤細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞中的陽性染色區(qū)出現(xiàn)在核周[2]，Kita Y[3]等研究OPN在食管鱗癌的陽性表達(dá)率為48%(n=175)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴管侵犯以及病理分期顯著相關(guān)，并且與患者預(yù)后不良相關(guān)，但不是獨(dú)立預(yù)測因子。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OPN的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、臨床分期、浸潤深度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，食管鱗癌中陽性表達(dá)率80%，較文獻(xiàn)高，可能與所取樣本例數(shù)過少有關(guān)。

β-catenin是多功能蛋白質(zhì)，在食管癌組織中，β-catnin呈現(xiàn)不同程度的胞漿表達(dá)，同時(shí)伴隨胞膜表達(dá)量減少或缺失，出現(xiàn)胞核異常表達(dá)，并與病理分化程度，靜脈侵犯，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率相關(guān)[4]。異常表達(dá)的β-catenin破壞了E-Cad-Cat復(fù)合物的功能，使細(xì)胞黏附減弱，而過度表達(dá)的OPN的GRGDS序列與腫瘤細(xì)胞表面的整合素otvl33相互作用，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號，使蛋白溶解酶的合成、分泌增多，溶解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步促使腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[5]。本實(shí)驗(yàn)表明食管鱗癌中β-catenin和分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，OPN的異常表達(dá)和β-catenin表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)，二者在食管鱗癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中協(xié)調(diào)作用。聯(lián)合檢測這兩種指標(biāo)可能有助于食管鱗癌的病理分期及預(yù)后的判斷。

[1]Chackalaparampil I，Peri A，et al.Cells in vivo and in vitro from osteopetrotic mice homozygous for c-src disruption show suppression of synthesis of osteopontin，a multifunctional extracellular matrix protein.Oncogene，1996，12(7):1457-1467.

[2]Casson AQWilson SM，McCart JA，et al.Ras mutation and expression of the ras-regulated genes osteopontin and cathepsin L in human esophageal cancer.Int J Cancer，1997，72(5):739-745.

[3]Kita Y，Natsugoe S，Okumura H，et al.Expression of osteopontin in oesophageal squamous cell carcinoma.Br JCancer，2006 Sep 4;95(5):634-638.

[4]楊小龍，李永領(lǐng)，龔永福.Β-catenin在食管鱗癌中的表達(dá)及意義.中國煤礦工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2004，7(11):1062-1064.

[5]張巧英，姚根有.骨橋蛋白與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展.國際遺傳學(xué)雜志，2006，29(3):235-238.