馮秋霞 程麗靜 蘆露 羅蘭 白艷 李萍 季軍 高政南

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的，目前尚不完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，腎臟的足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后均具有重要的作用。在各種致病因素作用下，足突細(xì)胞損傷可能的機(jī)制包括足突消失、足細(xì)胞肥大、脫落、凋亡，或上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換，其中受損后脫落的足細(xì)胞可隨尿液排泄[1-3]。本研究觀察了2型糖尿病(T2DM)患者尿中足細(xì)胞數(shù)量的變化，研究其與血清C反應(yīng)蛋白(CRP)的關(guān)系，以探討糖尿病腎病患者足細(xì)胞脫落的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 T2DM組:按照1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集我院2008～2010年門診和住院的124例T2DM患者(內(nèi)生肌酐清除率＞90 ml/min)，除外合并糖尿病急性并發(fā)癥、大血管并發(fā)癥、妊娠、感染、應(yīng)激、外傷、惡性腫瘤、其他可能的腎臟病，以及曾服用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、他汀類降脂藥、噻唑烷二酮類藥物者，空腹血糖＜7.0 mmol/L，餐后2 h

血糖＜10.0 mmol/L，血壓＜140/90 mm Hg。所有患者根據(jù)尿白蛋白排泄率(UAER)分為正常蛋白尿組(UAER ＜20μg/min，NA組)38例，微量白蛋白尿組(UAER 20～200μg/min，MA組)59例，大量蛋白尿組(UAER ＞200μg/min，CP組)27例。25名健康體檢者作為正常對照組(NC組)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 小鼠抗人podocalyxin單克隆抗體，由美國密西根大學(xué)David B.Kershaw教授惠贈，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠抗體IgG購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(P2HBG)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血肌酐(SCr)應(yīng)用全自動生化儀進(jìn)行檢測;糖化血紅蛋白(HbA1 c)測定采用金標(biāo)法;UAER測定采用放免法;CRP檢測采用免疫比濁法。

1.2.3 尿中足細(xì)胞觀察及足細(xì)胞數(shù)量檢測采用間接免疫熒光法。主要步驟如下:取新鮮中段尿液100 ml，以1200 r/min離心5 min。棄上清，取80μL尿沉渣甩片，室溫干燥30 min。丙酮4℃固定10 min，自然干燥，以0.01PBS沖洗。置1%Triton-1005 min，羊血清蛋白封閉，室溫30 min。小鼠抗人Podocalyxin單克隆抗體體積比1:20稀釋，4℃過夜。FITC熒光標(biāo)記山羊抗小鼠IgG體積比1:75稀釋，37℃孵育30 min。碘化丙啶染核，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光波長580 nm;每份標(biāo)本低倍鏡觀察全片，高倍鏡下確認(rèn)胞膜呈綠色、胞核為紅色的細(xì)胞為足細(xì)胞。由兩位作者同時觀察全片，記錄完整足細(xì)胞的個數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計算單位體積尿液的足細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用χ檢驗，計量資料采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 對照組和糖尿病各組的年齡、性別分布、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、體重指數(shù)(BMI)、TC、TG、FPG、P2 hBG、HbA1c兩兩比較無明顯差別，見表1。

表1 各組的資料比較(±s)

表1 各組的資料比較(±s)

注:與 NC組比較，*P＜0.05，＊＊P＞0.05，;與 NA 組比較，△P＜0.05;與 MA 組比較，☆P＜0.05，◆P＜0.01。

25 38 59 27年齡(歲) 53.4±7.6 52.9±7.3 55.0±9.1 54.8±8.6性別(男/女) 11/14 20/18 28/31 14/13病程(年) 0 5.4±2.8 9.1±4.3△ 12.5±7.7☆SBP(mm Hg) 126.4±6.5 132.1±4.7 129.3±8.3 133.8±7.22 dBP(mm Hg) 79.5±8.7 76.3±10.1 80.5±6.9 82.4±9.4 BMI(kg/m2) 23.02±3.32 25.87±2.09 26.14±3.07 24.34±4.45 TC(mmol/L) 4.75±2.09 4.95±1.67 5.03±1.73 4.87±1.34 TG(mmol/L) 1.97±2.62 2.35±2.85 2.17±1.64 2.08±2.21 FPG(mmol/L) 4.85±0.93 5.16±1.32 5.39±0.68 5.64±1.07 P2hPG(mmol/L) 6.93±1.54 7.04±3.89 7.12±1.09 7.15±2.53 HbAl C(%) - 6.5±1.7 6.7±1.4 6.4±1.5 UAER(μg/min) 7.15±4.82 9.34±8.27* 83.52±42.93△ 437.69±214.73◆SCr(μmol/L) 53.51±9.23 51.79±8.43* 79.23±12.36△ 97.46±213.54☆CRP(mg/L) 1.03±1.22 2.34±1.67＊＊ 6.83±2.31△ 11.37±4.3☆足細(xì)胞數(shù)量(個/ml) 0.3±0.3 0.4±0.2＊＊ 2.4±0.9△ 6.3±2.5 NC NA MA CP例數(shù)(個)組別☆

2.2 與對照組相比，糖尿病正常蛋白尿組的血CRP、尿足細(xì)胞數(shù)量無明顯升高(P＞0.05)。而糖尿病微量白蛋白尿組與正常蛋白尿組患者比較，大量蛋白尿組與微量白蛋白尿組比較，病程、UAER、SCr、CRP、尿足細(xì)胞數(shù)量均顯著升高(P ＜0.05或P＜0.01)。

3 討論

診斷糖尿病腎病的金標(biāo)準(zhǔn)是腎活檢，但因為該方法具有創(chuàng)傷性而較少應(yīng)用于日常臨床工作。UAER是目前臨床上評估糖尿病腎病最為常用的方法，但在合并感染、高蛋白飲食時容易受到干擾，無法真實地反映腎臟的病理改變。腎小球上皮細(xì)胞又稱足細(xì)胞，是腎小球濾過屏障的重要結(jié)構(gòu)。在糖尿病腎病患者，足細(xì)胞會受到損傷而發(fā)生凋亡和脫落[4，5]，最終排泄到尿液中。Podocalyxin是僅表達(dá)于足細(xì)胞的一種膜蛋白，故成為足細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。應(yīng)用抗podocalyxin的單克隆抗體對尿沉渣進(jìn)行免疫熒光染色，是一種檢測尿中足細(xì)胞的特異性方法[6]。Nakamura T[7]的研究表明，在伴有微量白蛋白尿和大量蛋白尿的DN患者尿中可檢測出足細(xì)胞，且后者尿中足細(xì)胞數(shù)量明顯多于前者。本研究通過間接免疫熒光染色方法，觀察了T2DM患者尿中足細(xì)胞及其排泄的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T2DM患者尿中足細(xì)胞數(shù)量隨UAER升高而增加，與Nakamura報道的結(jié)果一致。本研究還觀察到正常蛋白尿的DM患者也有少量的足細(xì)胞排泄，但與正常對照組無顯著性差異。國外曾有資料[8]表明足細(xì)胞的脫落可以早于尿蛋白的增加，與本研究的結(jié)果不同，可能與本研究的例數(shù)較少有關(guān)。由此可見，尿足細(xì)胞排泄較UAER可以更好地反映DN的病理改變，并與DN程度相關(guān)。本研究采用的尿足細(xì)胞檢測方法直接反映了腎臟的病理損害，而且具有無創(chuàng)傷性的特點，比UAER更加抗干擾，比腎活檢更易于臨床廣泛開展。

糖尿病腎病患者腎臟足細(xì)胞脫落的機(jī)制目前不十分清楚。2006年 Hotamisligil GS[9]首次提出了代謝性炎癥的概念，這種慢性低度、代謝引發(fā)的炎癥主要由營養(yǎng)物和代謝過剩所觸發(fā)。隨后尚有大量研究表明，炎癥在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中也扮演著重要的角色[10，11]，而炎癥因子CRP不僅是T2DM發(fā)病的強預(yù)測因子[12，13]，在DN患者也可見到CRP明顯升高[14，15]。本研究中 DM 患者的血 CRP水平不僅與UAER相關(guān)，也與其尿中足細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)。這一結(jié)果提示DN患者足細(xì)胞的損傷及脫落可能與代謝性炎癥有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)CRP可引起局部炎癥，促進(jìn)IL-6和黏附因子等的釋放，上調(diào)白細(xì)胞抗原表達(dá)，增加自由基和蛋白水解酶，最終導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)和功能改變[16]。這些機(jī)制可能參與并導(dǎo)致了足細(xì)胞的脫落。

本研究證實了DN患者尿中足細(xì)胞排泄數(shù)量增多，其數(shù)量與腎病的程度有關(guān)，而且與炎癥因子CRP的變化一致。提示慢性炎癥反應(yīng)可能是DN患者足細(xì)胞脫落的原因之一，但確切的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。尿足細(xì)胞數(shù)量的測定有可能成為評估糖尿病腎病的新手段。

圖1 免疫熒光染色顯示尿中足細(xì)胞

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