馬 慧 李麗麗 祝紅艷 陳麗靜 鐘 鳴 郭志富

（沈陽農業(yè)大學生物科學技術學院，遼寧省農業(yè)生物技術重點實驗室，遼寧沈陽 110161 ）

羽衣甘藍甘油-3-磷酸?；D移酶基因的克隆及序列分析

馬 慧 李麗麗 祝紅艷 陳麗靜 鐘 鳴 郭志富

（沈陽農業(yè)大學生物科學技術學院，遼寧省農業(yè)生物技術重點實驗室，遼寧沈陽 110161 ）

以羽衣甘藍品種白孔雀為試驗材料，通過同源克隆和RACE方法從低溫誘導的羽衣甘藍幼苗中分離得到了羽衣甘藍甘油-3-磷酸?；D移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）基因的全基因序列，采用生物學軟件對該序列 進行生物信 息學分析。結果表明：該基因全長1 558 bp，推測其編碼451個氨 基酸，并命名為BaGPAT。序列分析發(fā)現(xiàn)，羽衣甘藍BaGPAT基因推導的氨基酸與已知其他植物GPAT基因序列有54%～85%的相似性。聚類分析結果顯示：羽衣甘藍GPAT（BaGPAT）基因與擬南芥和寬葉獨行菜GPAT基因親緣關系較近。

羽衣甘藍；冷誘導；甘油-3-磷酸酰基轉移酶（GPAT）；基因克隆

低溫是限制植物生長和產量形成的重要因素之一，生物膜的膜脂不飽和度是植物抗寒性的重要生理指標。甘油-3-磷酸?；D移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）基因是磷酰甘油生物合成過程中的第1個酰基酯化酶基因，對決定植物膜的不飽和度起關鍵作用，與植物抗寒性密切相關。目前已從許多植物如豌豆、擬南芥、紅花、南瓜、黑籽南瓜、水稻、菠菜、黃瓜、柑橘類植物、百合（Lyons，1973；Murata et al.，1992；Wolter et al.，1992；Ishitani et al.，1998；楊明摯 等，1999；劉繼梅 等，2000；Ariizumi et al.，2002；Tamura et al.，2007；吳波和劉勇，2010；陳麗靜 等，2011）中克隆到GPAT基因片段甚至全基因序列，并研究了其部分功能，但是在甘藍類植物中未見該基因克隆和功能分析的報道。

羽衣甘藍（Brassica oleraceaL. var.acephalaDC.） 為十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，喜冷涼氣候，耐寒性強，適于冬季花壇美化和盆栽，是我國北方冬季重要的觀賞植物。近年來對羽衣甘藍的抗寒性研究多集中在生理生化方面，對于羽衣甘藍的抗寒性分子機理以及如何提高其對低溫脅迫的抗性等方面的研究均較少。本試驗以耐寒性較強的羽衣甘藍品種白孔雀為試材，通過同源克隆和RACE技術克隆得到其GPAT基因，經測序正確后對該序列進行了同源性分析，并且根據對應氨基酸序列進行了聚類分析，以期為羽衣甘藍抗寒機制研究提供分子生物學依據。同時，本試驗獲得了羽衣甘藍抗寒功能基因，對今后利用基因工程技術改良植物抗寒性，培育抗寒新品種具有潛在的重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試羽衣甘藍品種為白孔雀，由沈陽農業(yè)大學林學院祝鵬芳老師提供。試驗于2012年春季在沈陽農業(yè)大學進行，將羽衣甘藍種子播于育苗穴盤中，置于大棚中培養(yǎng)。當幼苗長至2～3片葉時，進行4 ℃低溫處理，16 h后取 樣，置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株與質粒

大腸桿菌菌株E.coliTop10為沈陽農業(yè)大學140實驗室保存；T載體 pGM18-T vector 購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 酶和試劑

DNA marker、T4DNA連接酶、pGM-18T載體、IPTG、X-Gal、PrimeScriptTM反轉錄試劑盒為寶生物工程（大連）公司產品，M-MLV反轉錄酶購自Promage公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，RNAprep pure Plant Kit試劑盒、Taq酶為天根生化科技（北京）有限公司產品，DEPC為Promaga公司產品。

所用引物（表1）的合成由賽百盛公司完成，測序由天根生化科技（北京）有限公司、上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

表1 羽衣甘藍GPAT基因克隆所用引物

引物設計采用Primer 5.0軟件，序列分析采用DNAMAN和MAGE 4.0軟件。

1.4 試驗方法

1.4.1 羽衣甘藍總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用植物總RNA提取試劑盒（ RNAprep pure Plant Kit）提取經冷誘導處理的羽衣甘藍總RNA。cDNA第一鏈的合成采用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒合成，-20 ℃保存。

1.4.2 羽衣甘藍GPAT基因的克隆、鑒定及測序 在Genbank中廣泛查詢GPAT基因的相關序列信息，設計GPAT基因的簡并性引物GPATF1、GPATR1、GPATF2、GPATR2。以反轉錄得到的cDNA為模板，進行巢式擴增，得到中間片段。

擴增中間保守區(qū)片段反應體系（25 μL）：cDNA/第1輪產物2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL（10 mmol·L-1），上下游引 物 各 1 μL（10 μmol·L-1），TaqDNA 酶 0.5 μL，加ddH2O至25 μL。反應條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，53 ℃，45 s，72 ℃，60 s，35個循環(huán)；72 ℃，10 min。以3′通用引物1反轉錄獲得的cDNA為模板，以GPAT3-1、GPAT3-2為上游引物，以3′通用引物2為下游引物進行巢式擴增，直到得到單一清晰的3′目的片段。

3′RACE 反應體系（25 μL）同上。反應條件： 94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，60 s，34 個循環(huán)；72 ℃，10 min。

根據已克隆出的GPAT基因序列，在起始密碼子處設計上游引物，采用嵌套PCR擴增GPAT 5′端。反應條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，90 s，34個循環(huán)；72 ℃，10 min。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段。將回收的PCR產物與pGM-18T vector連接，轉化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，菌落在含有X-gal和IPTG的LB（Amp+）固體培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選，隨機挑取8～10個陽性克隆，在LB（Amp+）固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后進行菌落PCR鑒定。

鑒定結果為陽性的克隆菌株穿刺到含有LB（Amp+）固體培養(yǎng)基的離心管中，由天根生化科技（北京）有限公司進行序列測定。用Blast 和DNAMAN軟件進行序列比較，用MEGA4.0軟件構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 羽衣甘藍GPAT基因的克隆

以羽衣甘藍cDNA為模板，簡并引物G PATF、GPATR擴增出約700 bp的部分保守區(qū)片段（圖1），在獲得的保守區(qū)設計反向引物和正向引物分別進行5′RACE和3′RACE擴增，得到3′端片段約680 bp（圖2）和5′端片段約750 bp（圖3）。

使用DNAMAN軟件進行序列拼接后，得到羽衣甘藍甘油-3-磷酸?；D移酶基因的全長cDNA序列，命名為BaGPAT。

2.2 羽衣甘藍BaGPAT基因序列分析

圖1 保守區(qū)序列擴增結果

圖 2 3′ RACE 擴增結果

圖 3 5′ RACE 擴增結果

將拼接得到的羽衣甘藍GPAT基因（BaG-PAT）經DNAMAN軟件分析，找到起始密碼子和終止密碼子，發(fā)現(xiàn)是2個具有完整編碼區(qū)的cDNA，由此得出GPAT基因是基因家族。用 Blast 軟件進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)這2個基因的核苷酸序列與擬南芥、寬葉獨行菜、南瓜、蓖麻、甜椒等植物中的GPAT基因均具有較高的同源性，這表明已經成功地克隆到了羽衣甘藍GPAT基因序列。

羽衣甘藍GPAT1和GPAT2基因序列已經在GenBank注冊（KC013241和KC013242），并分別命名為BaGPAT1和BaGPAT2。初步分析羽衣甘藍GPAT1和GPAT2基因全長均為1 558 bp，編碼451個氨基酸。

從氨基酸比對結果可以看出（圖4），羽衣甘藍GPAT1和GPAT2對應的氨基酸序列在N末端差異比較大，氨基酸序列間有90%的相似度。

將得到的BaGPAT1和BaGPAT2基因的氨基酸序列進行多序列比對分析，截取部分相似性較高的比對結果。由圖5可以看出：存在1個高度保守的區(qū)域（WIAPSGGRDRP），這段保守區(qū)域為LPLAT基因超級家族酶類的催化活性區(qū)，此家族多為催化?；o酶A（acylCoAs）或者?；d體蛋白（acylCoACPs）中的?；c受體蛋白結合的?；D移酶類。

圖4 羽衣甘藍GPAT1與GPAT2基因氨基酸序列比對結果

圖5 羽衣甘藍BaGPAT基因氨基酸序列比對的部分結果

分別將由BaGPAT1和BaGPAT2基因推導的氨基酸序列和已知其他植物的GPAT基因推導的氨基酸序列進行相似性比較。由表2可見，BaGPAT1和BaGPAT2與已知其他植物GPAT基因序列的相似性為54%～85%；其中與擬南芥相似性最高，為85%和84%；其次是寬葉獨行菜、日本蜜柑和南瓜，相似性都在60%以上。由此比對結果可以看出，羽衣甘藍GPAT基因與擬南芥、寬葉獨行菜等十字花科植物基因的同源性較高。

表2 羽衣甘藍BaGPAT基因氨基酸序列相似性比對結果

2.3 羽衣甘藍BaGPAT基因氨基酸序列聚類分析

為了進一步研究不同物種GPAT蛋白之間的進化關系，使用Clustalx軟件和njpot軟件進行聚類分析。結果顯示（圖6）：羽衣甘藍GPAT（BaGPAT）基因與擬南芥和寬葉獨行菜GPAT基因的親緣關系較近，氨基酸相似性分別達到80%、60%以上，和紅花、菠菜GPAT基因的親緣關系較遠，這與序列同源性比對結果一致。

圖6 羽衣甘藍BaGPAT基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

3 結論與討論

本試驗中克隆的羽衣甘藍BaGPAT基因編碼蛋白的氨基酸序列在260～270 Da、30 0～320 Da、380～390 Da 3個氨基酸區(qū)段多為疏水性、帶電荷或有活性基團等的氨基酸，如絲氨酸、賴氨酸、組氨酸、半胱氨酸，大多位置比較集中。這些氨基酸極可能與抗寒性植物中GPAT對C18∶1的優(yōu)先選擇性有關。由氨基酸序列比對分析結果可以看出：羽衣甘藍GPAT基因上述3個位點上的氨基酸序列與擬南芥等植物相似性較高，這與系統(tǒng)進化分析結果一致，從而推知羽衣甘藍具有較強的抗寒性。研究表明：GPAT基因間的差異不僅與生長環(huán)境和自身的抗寒性有著密切的聯(lián)系，并且可能存在多基因家族。Frentzen 等（1987）在南瓜葉綠體中發(fā)現(xiàn)了3種不同的GPAT基因，它們在對應氨基酸的N端有明顯的差異。說明基因的重復、置換或缺失在進化過程中實際上是頻繁發(fā)生的，直接導致了所編碼的氨基酸產生差異（Kianian & Quiros，1992）。本試驗克隆得到的兩個GPAT基因cDNA序列，雖然都編碼451個氨基酸，但是在N末端出現(xiàn)差異。完全相同的氨基酸殘基有407個，約占90%。氨基酸序列N末端的差異對于羽衣甘藍抗寒能力是否產生影響需要通過進一步的功能驗證。

在GPAT氨基酸序列中還存在1個高度保守的區(qū)域（WIAPSGGRDRP），在NCBI上經過Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)這段保守區(qū)域序列為LPLAT基因超級家族酶類的催化活性區(qū)，此家族多為催化?；o酶A（acylCoAs）或者?；d體蛋白（acylCoACPs）中的?；c受體蛋白結合的?；D移酶類，用于將脂肪?；D移到3-磷酸甘油的C-1位上合成1-酰基-sn甘油-3-磷酸（溶血磷脂酸），對決定植物膜PG的不飽和度起關鍵作用，從而決定了植物的抗寒性。

本試驗從羽衣甘藍中克隆到甘油-3-磷酸?；D移酶基因（GPAT），下一步將進行GPAT基因功能研究，為全面了解羽衣甘藍的抗寒機理，進一步通過轉基因途徑提高羽衣甘藍抗寒能力奠定理論基礎。

陳麗靜，孫春玉，鐘鳴，阮燕曄，明軍，雷家軍．2011．冷脅迫下王百合GPAT基因保守區(qū)克隆及表達分析．西北植物學報，31（9）：1726-1731．

劉繼梅，陳善娜，鄢波，黃興奇，楊明摯．2000．不同抗冷性水稻中編碼甘油-3-磷酸轉酰酶的部分cDNA的序列比較研究．云南植物研究，22（3）：317-321．

吳波，劉勇．2010．柑橘類植物GPAT基因片段克隆和SNP分析．江西農業(yè)大學學報，32（1）：51-56．

楊明摯，陳善娜，鄢波，劉繼梅，黃興奇．1999．黑籽南瓜甘油-3-磷酸?；D移基因的克隆及系列分析．云南植物研究，21（2）：139-143．

Ariizumi T，Kishitani S，Inatsugi R，Nishida I，Murata N，Toriyama K．2002．An increase in unsaturation of fatty acids in phosphatidylglycerol from leaves improves the rates of photosynthesis and growth at low temperatures in transgenic in rice seedlings．Plant & Cell Physiology，43（7）：751-758．

Frentzen M，Nishida I，Murata N．1987．Properties of the plastidial acyl-（acyl-carrier-protein）：glycerol-3-phosphate acyltransferase from the chilling-sensitive plant squash Cucurbita moschata．Plant Cell Physio，28：1195-1201．

Ishitani M，Xiong L，Lee H，Stevenson B，Zhu J K．1998．HOS1a genetic locus involved in cold-responsive gene expression in Arabidopsis．Plant Cell，10：1151-1161．

Kianian S F，Quiros C F．1992．Generation of aBrassica oleraceacomposite RFLP map：linkage arranagements among various population and evolutionary implications．Theoretical and Applied Genetics，84：544-554．

Lyons J M．1973．Chilling injury in plants．Ann Rev Plant Physiol，24：445-466．

Murata N，Ishizaki N O，Higashi S．1992．Genetically engineered alteration in the chilling sensitivity of plants．Nature，36（6371）：710-713．

Tamura K，Dudley J，Nei M，Kumar S．2007．MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA） software version 4.0.Mol Biol Evol，24：1596-1599．

Wolter F P，Schmidt R，Heniz E．1992．Chilling sensivity ofArabidopsis thalianawith genetically engineered membrane lipids．Eur Mol Biol Organ J，11（13）：4685-4692．

Cloning and Sequencing Analysis of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase Gene of Brassica oleracea L. var. acephalea DC.

MA Hui，LI Li-li，ZHU Hong-yan，CHEN Li-jing，ZHONG Ming，GUO Zhi-fu
（College of Biological Science and Technology，Shenyang Agricultural University，Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Liaoning Province，Shenyang 110161，Liaoning，China）

WithBrassica oleraceaL. var.acephaleaDC. variety‘Baikongque’as experimental material，by homology cloning and RACE method，we isolated from low temperature induction ofBrassica oleraceaL. var.acephaleaDC. seedlings the full gene sequences ofBrassica oleraceaL. var.acephaleaDC. glycerin-3-phosphate acyltransferase （GPAT） gene，and analyzed the sequences for bioinformatics by biology software．The results show that this gene is 1 558 bp in length，speculated encoding 451 amino acids，and is namedBaGPAT．TheBaGPATgene sequence has 54%-85%similarities in amino acids，when compared with other species in sequencing analysis．The results of clustering analysis show that the genetic relationship ofBaGPAT，Arabidopsis thalianaGPATandLepidium latifolium GPATis closer.

Brassica oleraceaL. var.acephaleaDC. ；Cold induced；Glycerin-3-phosphate acyltransferase （GPAT）；Gene cloning

S635.9

A

1000-6346（2013）08-0032-07

2013-01-06；接受日期：2013-02-28

遼寧省重點實驗室項目

馬慧，女，副教授，主要從事細胞分子生物學方面的研究，E-mail：mahui1972@163.com

致謝：本試驗材料由沈陽農業(yè)大學林學院祝鵬芳老師提供，特此表示感謝。