傅 亮 易九龍 陳思謙 吳炳鴻

（1.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.廣州市如豐果子調(diào)味食品有限公司，廣東 廣州 511330）

傳統(tǒng)的廣式米醋通常以米酒及食用酒精為原料，以木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）作為主要產(chǎn)酸菌，采用表面靜止發(fā)酵法生產(chǎn)［1］。發(fā)酵周期一般為40d以上，發(fā)酵總酸在3.5～4.5g／100mL，業(yè)內(nèi)普遍認為廣式米醋的發(fā)展應(yīng)縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵酸度。生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，采用分批補料發(fā)酵法生產(chǎn)的廣式米醋總酸，高于單批發(fā)酵總酸度。武斌等［2］研究也表明，以巴氏醋桿菌為菌種采用分批發(fā)酵法能明顯提高醋酸度和乙醇轉(zhuǎn)化率，縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約成本。

本試驗采用廣州如豐果子調(diào)味食品有限公司在發(fā)酵車間分離的木醋桿菌菌株RF4作為發(fā)酵菌種，研究發(fā)酵總酸的變化規(guī)律，比較發(fā)酵過程中纖維素膜內(nèi)與發(fā)酵液中菌體數(shù)的差異，探討最適原料酒精度，并研究通過在發(fā)酵過程中采用分批補料法提高總酸的可行性并進行工藝參數(shù)的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

菌種：自廣州如豐果子調(diào)味食品有限公司米醋生產(chǎn)車間分離出的主要產(chǎn)酸菌RF4，經(jīng)16SrDNA鑒定為葡糖醋桿菌屬的木醋桿菌 （Gluconacetobacter xylinus）［3］；

纖維素酶：酶活18 391U／g，美國Sigma公司；

乙醇、碳酸鈣、氫氧化鈉等：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：HR－120型，上海精密科學儀器有限公司；

高壓蒸汽滅菌器：YQX－SG46－280S型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

超凈工作臺：SW－CJ－1BU型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

生化培養(yǎng)箱：PYX－190－A型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種及培養(yǎng)基的制備

（1）液體菌種的制備［4］：10mg／mL葡萄糖、10mg／mL酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入5%乙醇（V／V），冷卻至室溫后接種RF4斜面菌種30℃下培養(yǎng)7d，菌落數(shù)測定為1.83×107CFU／mL。

（2）發(fā)酵液的制備［5］：10mg／mL葡萄糖、10mg／mL酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入5%乙醇（V／V），冷卻至室溫后接種5% （V／V）菌種培養(yǎng)液，裝液量為150mL，30℃下于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（3）平 板 計 數(shù) 培 養(yǎng) 基 的 制 備［6］：10mg／mL 葡 萄 糖、10mg／mL酵 母 粉、20mg／mL 碳 酸 鈣、15mg／mL 瓊 脂，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入3%無水乙醇，制成碳酸鈣平板備用。

1.2.2 發(fā)酵總酸的測定 參照GB／T 5009.41——2003。

1.2.3 發(fā)酵液及細菌纖維素膜內(nèi)木醋桿菌菌體數(shù)的測定

（1）細菌纖維素膜酶解液制備［7］：準確稱量發(fā)酵液中生成的完整濕狀細菌纖維素膜0.5g，加入0.1% （V／V）已活化好的纖維素酶溶液，用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液調(diào)pH至5.0，蒸餾水定容至10mL，35℃水浴至膜完全崩解，得纖維素膜酶解液。

（2）平板菌落計數(shù)法［8］：以梯度稀釋法分別接種木醋桿菌發(fā)酵液和細菌纖維素膜酶解液，30℃恒溫培養(yǎng)96h。選取菌落周圍出現(xiàn)透明圈的菌落計數(shù)，根據(jù)梯度稀釋倍數(shù)計算實際菌體數(shù)。從發(fā)酵第4天開始，每3d測定1次菌落數(shù)至第16天，單位CFU／g。

1.2.4 發(fā)酵過程中補加乙醇可行性試驗與總酸測定 在發(fā)酵至第10天時補加2%（乙醇體積／發(fā)酵液體積）乙醇1次，每2d測定1次總酸，測定至第20天。

1.2.5 分批補料發(fā)酵最優(yōu)條件的確定 對分批補料發(fā)酵液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，取每次乙醇添加量、間隔時間、開始補加時間及補加次數(shù)為因素進行四因素三水平的正交試驗，因素水平表見表1。以發(fā)酵液中總酸為指標進行因素水平的評價。以上每組試驗均做3次平行，要求誤差小于5%，取算術(shù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液和細菌纖維素膜內(nèi)木醋桿菌菌落數(shù)分布比較

木醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，細菌纖維素膜及發(fā)酵液內(nèi)都存在菌體。由比較結(jié)果（表2）可知，纖維素膜內(nèi)及發(fā)酵液中的木醋桿菌菌體數(shù)自發(fā)酵第4天開始顯著上升，第10天左右分別達到峰值，然后基本維持穩(wěn)定，為菌體生長穩(wěn)定期。隨著底物的耗盡和產(chǎn)物的積累，二者的菌體數(shù)在第13天時均開始下降，至第16天分別為0.98×1010CFU／g和4.00×107CFU／g，在整個發(fā)酵過程中，細菌纖維素膜內(nèi)的細胞數(shù)均遠高于發(fā)酵液內(nèi)的細胞數(shù)，前者在第10天時約為后者的300倍。結(jié)果表明，傳統(tǒng)的廣式米醋生產(chǎn)采用表面發(fā)酵法有利于菌體大量集中在氣液交界的膜中，有助于耗氧代謝及傳質(zhì)，有利于發(fā)酵產(chǎn)酸，隨后的分批補料發(fā)酵也應(yīng)維持細菌纖維素膜的完整性。

表1 因子水平表Table 1 Factor level table

表2 發(fā)酵液及細菌纖維素膜內(nèi)木醋桿菌菌體數(shù)Table 2 Cell number of Gluconacetobacter xylinus in fermented liquid and bacterial cellulose membrane

2.2 初始酒精度對木醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

木醋桿菌在發(fā)酵過程中，酒精濃度的高低會影響菌體的生長和代謝［8，9］。初始酒精度對產(chǎn)酸影響見圖1。在酒精含量為5% （V／V）時總酸可達4.2g／100mL左右，為其最適原料酒精度。

2.3 分批補料發(fā)酵提高總酸度的初步可行性

由圖2可知，不補加乙醇組在第12天左右酸度達到最大值，初步確定在第10天補加乙醇，補加乙醇組在第16天酸度達到最大值（5.35g／100mL），且遠高于不補加乙醇組。由此可見，發(fā)酵過程中補加乙醇可以提高最終總酸，通過分批補料法發(fā)酵提高廣式米醋總酸是可行的。

圖1 不同酒精含量對產(chǎn)酸的影響Figure 1 Total acidity under different alcohol content

圖2 單批發(fā)酵法與補料法所產(chǎn)總酸度比較Figure 2 Total acidity of single batch fermentation and fed－batch fermentation

2.4 補料發(fā)酵最優(yōu)條件的確定及驗證實驗

正交優(yōu)化試驗結(jié)果見表3。由表3可知，補料發(fā)酵過程中影響發(fā)酵產(chǎn)酸量的因素主次順序為A＞B＞C＞D，即乙醇添加量＞間隔時間＞開始補加時間＞補加次數(shù)，最優(yōu)組合為A3B1C1D2，即每次乙醇添加3mL，占發(fā)酵液體積2%，間隔時間為2d，在發(fā)酵第6天開始補加，補加次數(shù)為3次。按照最優(yōu)組合A3B1C1D2進行驗證實驗，重復(fù)5次并以單批發(fā)酵作對比，最優(yōu)組合產(chǎn)酸量均穩(wěn)定在7.29g／100mL，而單批發(fā)酵僅為4.20g／100mL。

3 結(jié)論

（1）分批補料發(fā)酵法提高廣式米醋總酸的最佳工藝為在發(fā)酵第6天開始，每隔2d添加發(fā)酵液體積2%的酒精，補加3次，最終酸度可達7.29g／100mL，較單批發(fā)酵提高了73.6%。

表3 補料發(fā)酵正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Orthogonal experiment design and analysis of fed－batch fermentation

（2）由于木醋桿菌在發(fā)酵過程中的最適酒精度為5%（V／V），較低的酒精量導(dǎo)致醋酸產(chǎn)量低，過高的酒精含量則會抑制木醋桿菌的生長代謝，單批發(fā)酵受制于此難以生產(chǎn)出高酸度米醋。本試驗通過補加酒精法發(fā)酵既滿足了木醋桿菌產(chǎn)酸的需要，又不致于酒精度過高而抑制其生長代謝，研究結(jié)果對于生產(chǎn)廣式高酸米醋具有積極意義。

（3）本試驗僅以酸度為指標對分批補料發(fā)酵法的工藝進行了優(yōu)化，對于如何在提高酸度的同時改善米醋其它風味品質(zhì)還有待于更深入的研究。

（4）特別值得注意的是，傳統(tǒng)的廣式米醋發(fā)酵所用的木醋桿菌，在發(fā)酵產(chǎn)酸的同時會合成細菌纖維素膜漂浮于發(fā)酵液表面，與中國其它醋種發(fā)酵有顯著不同的特征。以酒精為代表的碳源，在轉(zhuǎn)化為醋酸的同時，也合成了細菌纖維素。本試驗研究表明細菌纖維素膜的存在，有助于富集大量菌體于膜內(nèi)，且漂浮于發(fā)酵液表面有助于利用空氣中的氧，并進一步有助于氧化酒精轉(zhuǎn)化成乙酸。故分批補料過程中，不得破壞細菌纖維素膜。生產(chǎn)實踐中也發(fā)現(xiàn)，纖維素膜完整性的破壞，會極大降低最終制品的總酸。因此，如何在發(fā)酵過程中保持纖維素膜的完整性，如何將乙醇盡量多的轉(zhuǎn)化為乙酸，都為下一步設(shè)計高效連續(xù)生產(chǎn)的生化反應(yīng)器、調(diào)整生產(chǎn)工藝提出了新的課題。

1 傅亮，陳思謙，易九龍，等.細菌纖維素膜對木醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)廣式米醋的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（2）：123～125.

2 武斌，李麗，趙良啟.醋酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及醋酸分批發(fā)酵［J］.食品與藥品，2007，9（1）：11～14.

3 傅亮，易九龍，陳思謙，等.傳統(tǒng)廣式米醋中醋酸菌的分離與鑒定［J］.中國調(diào)味品，2012，37（6）：57～60.

4 臧晉，劉鳳霞，李永祥，等.高產(chǎn)醋酸菌的分離選育［J］.中國釀造，1999（5）：20～22.

5 陳義倫.優(yōu)質(zhì)蘋果醋釀造技術(shù)及主要風味物質(zhì)研究［D］.濟南：山東農(nóng)業(yè)大學，2002.

6 魏長慶，王海慶，張凌，等.葡萄果醋發(fā)酵用醋酸菌的分離及鑒定［J］.中國釀造，2010（4）：42～45.

7 賈士儒，歐竑宇，馬霞，等.細菌纖維素結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的初步研究［J］.纖維素科學與技術(shù)，2002，10（3）：25～29.

8 侯小歌，杜紅陽，李學思，等.宋河大曲中醋酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸特性［J］.中國釀造，2011（4）：112～115.

9 Kiyoshi T，Tomoko A，Masahiro F，et al.Cellulose production by acetic acid－resistant Acetobacter xulinum ［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1997，84（3）：228～231.