黃艷梅 黃卓煥 馮榮華 李東霞 賴(lài)衛(wèi)華

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，江西 南昌 330077）

β－受體激動(dòng)劑俗稱(chēng)“瘦肉精”，屬于苯乙胺類(lèi)藥物（PEAs）［1］，因能與動(dòng)物機(jī)體內(nèi)絕大多數(shù)組織細(xì)胞膜上的β受體結(jié)合而得名，因能夠調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮、松弛氣管平滑肌及促使體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)素重新分配，有一定的藥用價(jià)值，常作為治療哮喘的藥物［2］。另外，因β－受體激動(dòng)劑具有使能量再分配、減少脂肪沉積、增加酮體瘦肉率、以及促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，使得近年來(lái)β－受體激動(dòng)劑濫用于畜產(chǎn)品養(yǎng)殖中。若人類(lèi)攝入量過(guò)大，會(huì)出現(xiàn)毒副作用，如肌肉振顫、心慌、戰(zhàn)栗、頭疼、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)癥狀，特別是對(duì)高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡［3］。為了防止β－受體激動(dòng)進(jìn)入人類(lèi)的食物鏈，歐盟頒布規(guī)定禁止在畜牧生產(chǎn)中使用該類(lèi)藥物作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑［4］。中國(guó)農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國(guó)家藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合于2002年發(fā)布《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》，將部分β－受體激動(dòng)劑列入其中［5］。

目前檢測(cè)β－受體激動(dòng)劑的方法主要有兩種：① 快速篩查技術(shù)：主要有酶聯(lián)免疫技術(shù)［6－8］和免疫層析技術(shù)［9］，前者檢驗(yàn)特異性強(qiáng)、試驗(yàn)結(jié)果較為準(zhǔn)確、試驗(yàn)重復(fù)性強(qiáng)；后者操作簡(jiǎn)單且可現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)?？焖俸Y查法一般只用于β－受體激動(dòng)劑半定量或定性檢測(cè)，且多殘留定量分析受限，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，必須通過(guò)儀器確證后方能作為監(jiān)管部門(mén)的執(zhí)法依據(jù)。② 確證分析技術(shù)，包括氣相色譜－串聯(lián) 質(zhì)譜法［10］和 液 相 色 譜 － 串 聯(lián) 質(zhì) 譜 法［1，11，12］。色 譜 － 串 聯(lián)質(zhì)譜法，可同時(shí)對(duì)多種β－受體激動(dòng)劑定性，檢測(cè)結(jié)果精確、靈敏度高，結(jié)果可靠且為國(guó)際所公認(rèn)的執(zhí)法依據(jù)［4］。

檢測(cè)動(dòng)物組織或代謝物中β－受體激動(dòng)劑的多殘留，對(duì)食品安全的評(píng)價(jià)及監(jiān)控具有重要的意義。β－受體激動(dòng)劑經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)代謝后主要以原尿及其代謝物形式排出，檢測(cè)動(dòng)物尿液中β－受體激動(dòng)劑多殘留的含量顯得更直接、方便、全面，可實(shí)現(xiàn)宰前檢測(cè)。中國(guó)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告－11－2008［13］規(guī)定了豬尿中西馬特羅、沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺4種β－受體激動(dòng)劑單個(gè)或混合物殘留量的液質(zhì)檢測(cè)方法，但β－受體激動(dòng)劑的種類(lèi)繁多、性質(zhì)差異較大，若只以檢測(cè)少數(shù)幾種興奮劑作為尿檢的指標(biāo)，不能全面地分析該原料是否受到β－受體激動(dòng)劑的污染或有違法添加。

本試驗(yàn)參照中國(guó)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告－11－2008前處理方法，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜，在正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，測(cè)定經(jīng)鹽酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶酶解，異丙醇－乙酸乙酯液液萃取，MCX柱子固相萃取后試樣中的9種β－受體激動(dòng)劑（包括特布他林、沙丁胺醇、西馬特羅、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、噴布特羅）。制備一系列β－受體激動(dòng)劑濃度的豬尿樣本，通過(guò)其平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、相關(guān)系數(shù)等參數(shù)初步評(píng)估“公告”前處理方法結(jié)合選取的液相和質(zhì)譜測(cè)定條件，增加檢測(cè)項(xiàng)目的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

特布他林、沙丁胺醇、西馬特羅、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、噴布特羅標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；

β－鹽酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶、沙丁胺醇D3、萊克多巴胺D3、克倫特羅D9內(nèi)標(biāo)物：美國(guó)Sigma公司；

甲醇、甲酸：色譜純，美國(guó)Tedia公司；

乙酸銨、氫氧化鈉、氨水：分析純，天津大茂試劑廠；

異丙醇、乙酸乙酯：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 設(shè)備

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent1260／6410A型，美國(guó)安捷倫公司；

恒溫水浴振蕩器：SHA－C型，常州國(guó)華電器有限公司；

渦旋振蕩器：Vortex genie2型，美國(guó)Scientific Industries公司；

高速離心機(jī)：H－2050R型，湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

pH計(jì)：PHS－3B型，上海虹益儀器儀表有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE52－98型，上海亞榮生化儀器廠；

固相萃取柱：MCX型，美國(guó)Waters公司；

氮吹儀：TTL－DCⅡ型，上海深瑞儀器有限公司；

濾膜：4.5μm，美國(guó) Millipore公司。

1.2 前處理方法

1.2.1 酶解 準(zhǔn)確量取5mL豬尿試樣，于50mL離心管中，依次加入5mL 0.2mol／mL的乙酸銨緩液、40μLβ－鹽酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶，混勻，37℃，避光振蕩16h。

1.2.2 提取 樣本酶解16h后，添加100μL 100ng／mL的同位素內(nèi)標(biāo)，渦旋混勻，高速離心（10 000r／min，10min），轉(zhuǎn)移上清液于另一50mL離心管中，用5mol／mL的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上清液的pH至9.8±0.2。調(diào)節(jié)完pH值后，依次加入10mL異丙醇－乙酸乙酯和2mL的飽和氯化鈉溶液，渦旋振蕩5min，5 000r／min離心10min。轉(zhuǎn)移上清液至另一50mL離心管后，樣品進(jìn)行添加異丙醇－乙酸乙酯、飽和氯化鈉溶液的2次提取。將兩次得到的上清液合并在同一個(gè)離心管中，50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至殘留少許液體時(shí)，添加1mL乙醇，再旋轉(zhuǎn)至干。最后用5mL的乙酸銨緩沖液溶解殘?jiān)?，備用?/p>

1.2.3 凈化 依次用3mL甲醇、3mL水活化 MCX柱，備用液過(guò)柱，用3mL水、3mL 2%的甲酸水溶液、3mL甲醇依次淋洗MCX柱。再用5mL 5%的氨水甲醇溶液洗脫MCX柱于15mL的離心管中。洗脫液在50℃條件下，氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)?.5mL的甲醇－0.1%甲酸／水溶解，濾膜過(guò)濾，定容于1mL的進(jìn)樣瓶中。液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀備用。

1.2.4 繪制校正曲線 準(zhǔn)確量取適量特布他林、沙丁胺醇、西馬特羅、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、噴布特羅混合標(biāo)準(zhǔn)液，制備1，2，4，10，20ng／mL的一系列溶液（內(nèi)標(biāo)物均為10ng）。峰面積與對(duì)應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，并繪制校準(zhǔn)曲線。

1.3 儀器測(cè)定條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18（2.1mm×150mm 3.5μm）；流動(dòng)相：A 相：0.1%甲酸甲醇溶液；B相：0.1%甲酸／0.5%甲醇水溶液；梯度洗脫：0～5min，5%A線性變化至60%；5～10min，60%A線性變化至95%A；10.00～10.01min，95%A變化至5%A；10.01～18.00min，保持5%A；流速：0.3mL／min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：35℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)；電噴霧電壓：4.0kV；離子源溫度：300℃；干燥氣流速：7L／min；霧化氣壓力：310.3kPa；其它參數(shù)：見(jiàn)表1。

1.4 結(jié)果判定

以保留時(shí)間，陽(yáng)性樣品定性離子與定量離子相對(duì)豐度比值和標(biāo)準(zhǔn)品的離子相對(duì)豐度比值的比值在80%～120%為定性依據(jù)。由于缺少適合非諾特羅和噴布特羅的內(nèi)標(biāo)物，二者皆以外標(biāo)法定量。西馬特羅、特布他林、沙丁胺醇以沙丁胺醇D3為內(nèi)標(biāo)物，萊克多巴胺以萊克多巴胺D3為內(nèi)標(biāo)物，氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅以克倫特羅D9為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖

在選定的測(cè)定條件下，添加量為1ng／mL的混標(biāo)溶液的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

在MRM模式，分別對(duì)9種β－受體激動(dòng)劑特征離子對(duì)進(jìn)行監(jiān)控，得到其添加量為1ng／mL時(shí)相應(yīng)的出峰時(shí)間和響應(yīng)值，見(jiàn)表2。

表1 9種β－受體激動(dòng)劑的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、裂解電壓和碰撞能量Table 1 Monitoring ion pairs，cracking voltage and collision energy of 9β－agonists

圖1 總離子流色譜圖（1ng／mL）Figure 1 Total ion chromatogram of sample（1ng／mL）

表2 9種β－受體激動(dòng)劑的出峰時(shí)間和響應(yīng)值Table 2 Appearance times and response values of nineβ－agonists

2.2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)與檢測(cè)限

9種β－受體激動(dòng)劑線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)與檢測(cè)限見(jiàn)表3。

表3 9種β－受體激動(dòng)劑線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)與檢測(cè)限Table 3 Regression equations，correlation coefficients and LODs for nineβ－agonists

在選定的液相色譜、質(zhì)譜測(cè)定條件下，檢測(cè)添加量范圍為1～20ng／mL的西馬特羅、特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅，以目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)物的濃度比之為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。在相同的條件下，檢測(cè)相同濃度范圍的非諾特羅和噴布特羅，其濃度與峰面積進(jìn)行線性回歸。采用該方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，在1～20ng／mL的濃度范圍內(nèi)，9種β－受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997。因此，該方法具有較大的線性范圍和良好的線性相關(guān)性。選擇9種β－受體激動(dòng)劑添加量為1ng／mL，待測(cè)化合物的響應(yīng)值的信噪比折算為3倍信噪比時(shí)，樣品中9種β－受體激動(dòng)劑的檢測(cè)限在之間，結(jié)果表明，該方法檢測(cè)靈敏度高，可保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 平均回收率與RSD

選取空白試樣，添加水平為1，2，4，10，20ng／mL時(shí)，9種β－受體激動(dòng)劑的平均回收率 （n ＝4）在82.12%～118.61%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏為0.97%～11.53%，具體結(jié)果見(jiàn)表4。該方法準(zhǔn)確度和精密度可滿足9種β－受體激動(dòng)劑的檢測(cè)要求。

表4 9種β－受體激動(dòng)劑平均回收率Table 4 Recoveries of nineβ－agonists（n ＝4）

續(xù)表4

3 結(jié)論

本試驗(yàn)參照常規(guī)的前處理方法，采用新的檢測(cè)條件，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)豬尿樣本中9種β－受體激動(dòng)劑實(shí)行了同時(shí)檢測(cè)。結(jié)果顯示，在添加量為1～20ng／mL范圍內(nèi)，回收率為88.31%～118.61%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%～11.53%，儀器檢測(cè)限在0.01～0.12ng／mL。該方法具有線性范圍廣，回收率高，精度好，靈敏度高的特點(diǎn)，較之中國(guó)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告，其可增加β－受體激動(dòng)劑可檢項(xiàng)目。該法能滿足現(xiàn)有檢測(cè)要求，為興奮劑的市場(chǎng)監(jiān)控提供了有效的檢測(cè)手段。

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