王 鋒 / 上海市浦東新區(qū)計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)所

0 引言

合成色素因價(jià)格低廉、染色性能好、用量少等特點(diǎn)受到許多食品企業(yè)的青睞。合成色素是食品中添加的非營(yíng)養(yǎng)成分，而合成色素主要是以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)有機(jī)反應(yīng)化合而成的化合物。這類色素大多具有一定毒性，尤以偶氮化合物合成著色劑的致癌作用更明顯，因此對(duì)食品中色素的含量進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義。大量的研究報(bào)告指出，幾乎所有的合成色素都不能向人體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。某些不法商販為使復(fù)合調(diào)味料顏色鮮艷誘人，會(huì)添加人工合成著色劑。但由于復(fù)合調(diào)味料具有高脂肪、高蛋白質(zhì)等特性，給檢驗(yàn)的前處理工作帶來(lái)很大不便。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有具體規(guī)定前處理方法，本文結(jié)合實(shí)際工作和有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，挑選偶氮化合物合成著色劑中新紅、酸性紅、赤蘚紅為代表，建立有效測(cè)定復(fù)合調(diào)味料中合成著色劑的前處理方法，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠。

目前，國(guó)標(biāo)法（GB/T 5009.35-2003）使用高效液相色譜法檢測(cè)色素只適用于飲料、糖果、酒類、蜜餞等食品，不能檢測(cè)酸性紅，而且赤蘚紅的前處理方法與其他的色素提取方法不一樣，整個(gè)檢測(cè)工作繁瑣。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T1743-2006）使用高效液相色譜法檢測(cè)色素只適用于飲料、糖果，不能檢測(cè)新紅和赤蘚紅。但在實(shí)際工作中，經(jīng)常遇到半固體食品（如調(diào)味醬）和復(fù)合調(diào)味料（由兩種以上調(diào)味料添加或者不添加其他配料混合而成）需要檢測(cè)紅色素。由于這些食品含有蛋白質(zhì)、淀粉類大分子以及油脂，直接進(jìn)樣會(huì)堵塞、損傷色譜柱。而采用有機(jī)溶劑提取，操作過(guò)程繁瑣，對(duì)操作者健康的損害大，并且普通的高效液相色譜法測(cè)定需要梯度洗脫，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。為此，筆者對(duì)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行改進(jìn)，探討出針對(duì)復(fù)合調(diào)味料樣品的前處理方法。采用UPLC進(jìn)行調(diào)味料樣品中新紅、酸新紅、赤蘚紅的含量測(cè)定，獲得了良好的效果。

1 試驗(yàn)原理

食用色素就來(lái)源可分成兩大類：天然色素和合成色素。新紅、酸性紅、赤蘚紅這三種合成色素在酸性和中性條件下比較穩(wěn)定，能溶解于水和含水的溶劑中。聚酰胺是具有二極性的化合物，水溶性酸性染料在酸性條件下被聚酰胺粉吸附，而在堿性條件下被解吸，過(guò)濾后經(jīng)流動(dòng)相帶進(jìn)色譜柱后進(jìn)行分離，以保留時(shí)間定性，以峰面積定量。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 儀器、試劑與材料

2.1.1 儀器：超高效液相色譜儀 —— Agilent UPLC 1290配二極管陣列檢測(cè)器、恒溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器以及Agilent 化學(xué)工作站；ANKE TDL-5-A型離心機(jī)，轉(zhuǎn)速4 000 r/min；100目的砂心漏斗（或者G3垂融漏斗）； 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾器；氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器廠）；Milli-Q Integral 純水機(jī)。

2.1.2 試劑：甲醇：色譜醇；0.02 mol/L的乙酸銨溶液（經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾）；聚酰胺粉（尼龍6）：過(guò)200目篩；氨水；pH = 6的水（60℃）：水加檸檬酸溶液調(diào)PH值到6；無(wú)水乙醇-氨水-水（7+2+1）溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：新紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含92.0%）、酸性紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含68.0%）、赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含88.0%），上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均由Dr.Ehrenstorfer公司提供。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用純水溶解并定容，使新紅、酸性紅、赤蘚紅的濃度分別為（2.25、3.12、2.50）、（4.50、6.25、5.00）、（9.00、12.50、10.00）、（18.00、25.00、20.00）和（45.00、62.50、50.00）μg/mL。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件

甲醇-乙酸銨溶液（pH = 4，0.02 mol/L）；二元梯度洗脫（條件見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱 2.1×50 mm×1.8 μm；檢測(cè)器波長(zhǎng)：二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱箱溫度：25℃，后運(yùn)行10 min。l0%鎢酸鈉溶液，使蛋白質(zhì)沉淀，過(guò)濾，用少量水洗滌，收集濾液。液狀的樣品過(guò)濾后取濾液。

表1 梯度洗脫條件

2.2.3 色素的提取

色素的提取方法有許多，如：羊毛染色法、聚酰胺粉法、離子交換法、分子篩分離法等，最常用的是聚酰胺粉法。將收集的過(guò)濾液用檸檬酸溶液調(diào)pH = 6，并加熱到60℃。加入1 g調(diào)成粥狀的聚酰胺粉，用玻璃棒攪拌均勻。以砂心漏斗抽濾，用60℃pH = 4的水洗滌多次。用乙醇-氨水-水溶液解吸3-5次，直至解吸液無(wú)色，合并解吸液，加乙酸中和，用氮吹儀濃縮至近干，用水定溶至5 mL。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和測(cè)定

配 制 濃 度 分 別 為（2.25、3.12、2.50）、（4.50、6.25、5.00）、（9.00、12.50、10.00）、（18.00、25.00、20.00）和（45.00、62.50、50.00）μg/mL的新紅、酸性紅、赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。各進(jìn)樣10.0 μL進(jìn)行測(cè)定，記錄保留時(shí)間及峰面積。各濃度均重復(fù)進(jìn)樣2次，以不同濃度及相應(yīng)平均峰面積值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待儀器穩(wěn)定后，在同一色譜條件下，通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器分別進(jìn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)UPLC儀測(cè)定，以保留時(shí)間定性，用樣品峰面積和標(biāo)準(zhǔn)峰面積比較，外標(biāo)法定量。

3 結(jié)果與分析

2.2.2 樣品的前處理

現(xiàn)在市場(chǎng)上出售的復(fù)合調(diào)味料一般有三種：粉狀（如：燒肉粉），醬狀（如：火鍋調(diào)料），液狀（如：調(diào)味液）。粉狀的樣品用60℃的水反復(fù)溶解過(guò)濾提取色素，合并過(guò)濾液。醬狀的樣品加海砂少許，混勻、用熱風(fēng)風(fēng)干樣品(用手摸已干燥即可以)，加入30 mL石油醚攪拌，放置片刻，傾出石油醚。如此重復(fù)處理三次，以除去脂肪吹干后研細(xì)，全部轉(zhuǎn)入砂心漏斗中，用乙醇-氨溶液提取色素，直至色素全部提完，置水浴上濃縮至約20 mL，立即用1：10硫酸調(diào)溶液至微酸性再加1.0 mL 1：10硫酸，加1 mL

3.1 色譜分離圖

色譜圖顯示三種組分在同一濃度的條件下，分離效果好，分離時(shí)間比國(guó)標(biāo)方法明顯縮短。酸性紅的響應(yīng)值最大，新紅的響應(yīng)值最小。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

由表2可知，三種組分的溶度為2.25～ 62.50 μg/mL時(shí)，三者均呈良好線形關(guān)系，相關(guān)系數(shù)都超過(guò)0.999，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

選取同一份樣品（含有新紅、酸性紅、赤蘚紅），重復(fù)測(cè)定6次，其結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出該方法的重復(fù)性比較好，所測(cè)新紅、酸性紅、赤蘚紅的RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）值分別為1.5%、1.8%、1.4%。

表2 回歸曲線

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

選取同一份樣品（不含有新紅、酸性紅、赤蘚紅）分別加入高、中、低3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4 ?？梢钥闯觯录t、酸性紅、赤蘚紅的加標(biāo)回收率良好 (均超過(guò)90%，其平均回收率分別為94.3%、 97.3% 、94.3%），這保證了數(shù)據(jù)的可靠性。

表4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

4 討論與分析

4.1 樣品的前處理和提純

樣品的前處理和提純過(guò)程很重要，要充分去除雜質(zhì)（油脂、蛋白質(zhì)、淀粉、糖）以免影響吸附效果。復(fù)合調(diào)味料多種多樣，簡(jiǎn)單的樣品只含有淀粉雜質(zhì)（如增鮮劑），復(fù)雜的樣品含有油脂、蛋白質(zhì)、淀粉等雜質(zhì)（如火鍋調(diào)料）。如果不把這些雜質(zhì)除去，就會(huì)影響色素的提取和測(cè)定結(jié)果，同時(shí)會(huì)影響過(guò)濾效果及毀壞色譜柱。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑（石油醚）去除油脂、硫酸和鎢酸鈉沉淀蛋白質(zhì)、溫水溶解糖類的方法凈化樣品，以便于更好地提取色素。

4.2 色素的提取

在國(guó)標(biāo)方法中采用甲醇-甲酸溶液溶解天然色素的方法來(lái)除去天然色素，但是人工合成色素赤蘚紅能溶解于甲醇中，所以按照國(guó)標(biāo)方法來(lái)處理樣品時(shí)容易把樣品中本含有的赤蘚紅與雜質(zhì)一并洗去，使檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性，故國(guó)標(biāo)方法采用兩種方法來(lái)處理樣品，以便能提取到赤蘚紅色素。但是這種同一樣品采用兩種方法來(lái)提取色素的過(guò)程給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了繁瑣的工作，因而本實(shí)驗(yàn)采用不加甲醇-甲酸溶液，用大量60℃ pH = 4的水來(lái)洗聚酰胺粉提取液的方法進(jìn)一步去除雜質(zhì)。發(fā)現(xiàn)在色素的定性方面有良好的效果，使工作簡(jiǎn)單化。

4.3 儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所采用的設(shè)備與國(guó)標(biāo)方法中提到的有了很大的改進(jìn)：如采用氮吹的方法來(lái)濃縮提取液、采用超高液相色譜儀測(cè)定的方法來(lái)縮短檢測(cè)時(shí)間（檢測(cè)時(shí)間是原方法的三分之一）。

5 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同調(diào)味料色素的提取、采用氮吹技術(shù)濃縮、用超高效液相色譜儀測(cè)定的方法，來(lái)檢測(cè)復(fù)合調(diào)味料中部分紅色素。此方法簡(jiǎn)化了國(guó)標(biāo)中對(duì)樣品的前處理，合并了赤蘚紅色素與其他色素提取的不同方法，采用更先進(jìn)的氮吹儀和超高效液相色譜儀來(lái)縮短檢測(cè)時(shí)間。運(yùn)用該前處理方法操作步驟簡(jiǎn)單，工作強(qiáng)度小，并且最大限度避免了有機(jī)溶劑的使用，從而降低了試驗(yàn)的危害性，特別適用于大批量樣品的處理工作和測(cè)定，效果明顯改善。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 5009.1-2003 [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[2]國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì).SN/T 1743-2006 [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[3]葛宇. 食品中人工合成色素使用法規(guī)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展 [J]. 質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化，2011，09，31-35.