田懷香 李鳳華 馬 霞

（上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

目前，化學(xué)合成的奶味香精在市場(chǎng)上占有著重要的地位，然而隨著人們生活水平的提高和對(duì)天然與健康的關(guān)注，天然奶味香精越來(lái)越得到人們的青睞［1］。因此，尋求一種新的、有效的方法來(lái)生產(chǎn)天然高質(zhì)量的奶味香精是廣大科研工作者致力研究的方向。基于脂肪酶作用于乳脂可以產(chǎn)生脂肪酸，賦予奶制品獨(dú)特的奶香風(fēng)味，酶法水解奶油及奶制品成為一個(gè)有效方法［2］。此法能產(chǎn)生具有奶香特征的天然奶味香精，其香氣自然、柔和，奶香強(qiáng)度以150～200倍增加。1983年日本長(zhǎng)谷川公司公布了利用脂肪酶處理食用油、脂肪、糖和氨基酸生產(chǎn)奶香料的專利［3］。Verhaeghe等［4］通過(guò)從Rhizopus arrhizus中獲得的脂肪酶來(lái)水解黃油、奶油和人造奶油，武彥文等［5］利用脂肪酶Palatase水解奶油，得到的水解產(chǎn)物香氣自然，柔和，對(duì)加香產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量有明顯的改善和提高。黃漢榮等［6］將酶法和氧化熱裂解反應(yīng)相結(jié)合，以奶油為原料，利用優(yōu)選的脂肪酶，使奶油中的部分甘油三酯水解出游離脂肪酸，然后以該產(chǎn)物進(jìn)行氧化熱裂解，制得增香型奶香料。

為了獲得良好的乳脂肪風(fēng)味，可以以稀奶油、奶油或無(wú)水奶油為原料，利用脂肪酶對(duì)乳脂肪進(jìn)行適度水解制取奶油酶解產(chǎn)物。所得到的奶油酶解產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)適當(dāng)修飾，其香氣自然、柔和，且留香持久［7］，這是單體香料調(diào)配而成的同類乳品香精所達(dá)不到的。而且酶法生產(chǎn)乳品香精純度高、安全性好，因而具有極大的應(yīng)用價(jià)值。但是產(chǎn)品的香氣受酶解工藝的影響很大，本研究結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)制備天然奶味香精的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，為企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)和產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

稀奶油：食品級(jí)，上海光明乳業(yè)；

其他藥品試劑：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

超級(jí)恒溫水浴：601型，上海森地科學(xué)儀器有限公司；

pH計(jì)：Delta 320型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

恒溫磁力攪拌器：524G型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HHS型，金壇市岸頭國(guó)瑞實(shí)驗(yàn)儀器廠；

電子天平：BS124S型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

高剪切分散乳化機(jī)：FA25型，弗魯克公司（FLUKO）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

奶油→加乳化劑→加水→高速均質(zhì)機(jī)攪拌、乳化→巴氏殺菌→冷卻→調(diào)pH→添加脂肪酶→水解→滅酶→感官評(píng)定

1.2.2 單因素試驗(yàn)

（1）酶添加量對(duì)酶解反應(yīng)的影響：稱取10.0g稀奶油，0.150g單硬脂酸甘油酯，加入50.0mL蒸餾水，溫度為50.0℃，酶解時(shí)間為4.00h，pH 為7.80，酶添加量分別為原料奶油的350，450，550，650，750，850，950U／g·稀奶油，進(jìn)行酶解反應(yīng)。

（2）乳化劑種類對(duì)酶解反應(yīng)的影響：稱取10.0g稀奶油，加入50.0mL蒸餾水，溫度為50.0℃，酶解時(shí)間為4.00h，酶添加量為550U／g·稀奶油，pH 為8.00，乳化劑分別為span60、單硬脂酸甘油酯、tween60，進(jìn)行酶解反應(yīng)。

（3）乳化劑使用量對(duì)酶解反應(yīng)的影響：稱取10.0g稀奶油，加入50.0mL蒸餾水，溫度為50.0℃，酶解時(shí)間為3.50h，酶添加量為550U／g·稀奶油，pH 為8.00，乳化劑為單甘酯，乳化劑的使用量分別為0.050，0.100，0.150，0.200，0.250g，進(jìn)行酶解反應(yīng)。

（4）底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響：底物濃度分別設(shè)置為20%，40%，50%，60%，80%，100%，加入0.150g單硬脂酸甘油酯，溫度為60.0℃，酶解時(shí)間為3.50h，pH 為8.00，酶添加量為550U／g·稀奶油，進(jìn)行酶解反應(yīng)。

（5）pH 對(duì)酶解反應(yīng)的影響：稱取10.0g稀奶油，0.150g單硬脂酸甘油酯，加入50.0mL蒸餾水，溫度為50.0℃，酶添加量為550U／g·稀奶油，酶解時(shí)間為4.00h，pH 分別為6.00，6.50，7.00，7.50，8.00，8.50，9.00，進(jìn) 行 酶解反應(yīng)。

（6）酶解溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響：稱取10.0g稀奶油，0.150g單硬脂酸甘油酯，加入50.0mL蒸餾水，酶添加量為550U／g·稀奶油，pH為8.00，酶解時(shí)間為3.50h，反應(yīng)溫度分別為40.0，45.0，50.0，55.0，60.0，65.0，70.0 ℃，進(jìn)行酶解反應(yīng)。

（7）酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響：稱取10.0g稀奶油，0.150g單硬脂酸甘油酯，加入50.0mL蒸餾水，溫度為50.0℃，酶添加量為550U／g·稀奶油，pH 為8.00，酶解時(shí)間分別為2.50，3.00，3.50，4.00，4.50，5.00h，進(jìn)行酶解反應(yīng)。

1.2.3 感官評(píng)定 運(yùn)用九點(diǎn)快感標(biāo)度法對(duì)水解產(chǎn)物的香氣風(fēng)味和香氣強(qiáng)度進(jìn)行感官品評(píng)，并對(duì)各組感官結(jié)果評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素酶解工藝研究

影響酶解反應(yīng)的因素有酶添加量、乳化劑種類、乳化劑使用量、底物濃度、pH、酶解溫度和酶解時(shí)間。酶解反應(yīng)以感官評(píng)定為主要指標(biāo)、奶油脂解率為輔助指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)得到：當(dāng)酶添加量為550U／g稀奶油、乳化劑為單硬脂酸甘油酯、單甘酯使用量為稀奶油的1.50%、底物濃度為40.0%、pH 為8.00、酶解溫度為60.0℃、酶解時(shí)間為3.50h時(shí)，酶解產(chǎn)物的奶香味濃郁、香氣純正、愉悅度較好。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The standard of sensory evaluation

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采用Design－Expert 7.0.0軟件中的Box－Behnken Design（BBD）設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，乳化劑種類以及乳化劑使用量對(duì)于酶解反應(yīng)的影響較小，綜合多種因素選取底物濃度、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素作為變量，以感官評(píng)定分值為響應(yīng)值設(shè)計(jì)了4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平編碼見(jiàn)表2，響應(yīng)面分析方案和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面分析因素及水平Table 2 Variables and levels in response surface design

2.2.2 二次多項(xiàng)式回歸方程 采用Design－Expert 7.0.0軟件，對(duì)表3中酶解產(chǎn)物的感官評(píng)分分值（Y）進(jìn)行多元回歸擬合統(tǒng)計(jì)分析，得到酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、pH（C）、底物濃度（D）的二次多項(xiàng)式回歸方程：

由表4可知，該模型F值為45.16，表明該模型高度顯著；模型的P＜0.000 1，表明總體上模型各因素水平項(xiàng)極顯著；失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.120 6＞0.05），模型的R2＝0.975 1，修正后為＝0.953 5，表明模型的相關(guān)度很好，可以解釋酶解產(chǎn)物感官評(píng)分響應(yīng)值的變化情況，綜上說(shuō)明該模型所得結(jié)果與實(shí)際狀況擬合很好。

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Arrangement and experimental results of response surface design

2.2.3 方差分析 該二次方程回歸方差分析結(jié)果與回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表4。由表4可知，一次項(xiàng)A、C偏回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明酶解溫度和pH對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分有極顯著性影響；D偏回歸系數(shù)高度顯著，說(shuō)明底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分有高度顯著性影響；BC交互中影響高度顯著，其余項(xiàng)間的交互作用不是很明顯；二次項(xiàng)A2、B2、C2的偏回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平，D2的偏回歸系數(shù)達(dá)到高度顯著水平，所以由方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響均很顯著。綜合以上各參數(shù)情況表明該試驗(yàn)方法有效可靠，可以通過(guò)該回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表4 方差分析?Table 4 Analysis of variance

2.2.4 響應(yīng)面分析 4個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖1～4。

（1）酶解產(chǎn)物感官評(píng)分隨酶解溫度和酶解時(shí)間的變化：由圖1可知，在酶解體系pH為8.00，底物濃度為40.0%的情況下，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的奶香味先增強(qiáng)后減弱；而隨著酶解溫度的增大，酶解產(chǎn)物的奶香味也是先增強(qiáng)后減弱，且其增幅較酶解時(shí)間的增幅大，說(shuō)明酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響較酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響顯著。

（2）酶解產(chǎn)物感官評(píng)分隨酶解溫度和pH值的變化：由圖2可知，在酶解時(shí)間為3.50h，底物濃度為40.0%的情況下，隨著酶解溫度的增大，酶解產(chǎn)物的奶香味先增強(qiáng)后減弱；而隨著pH值的增大，酶解產(chǎn)物的奶香味也是先增強(qiáng)后減弱，且其增幅較酶解溫度的增幅大，說(shuō)明pH對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響較酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響顯著。

（3）酶解產(chǎn)物感官評(píng)分隨酶解時(shí)間和底物濃度的變化：由圖3可知，在酶解溫度為60.0℃，酶解體系pH為8.00的情況下，隨著酶解時(shí)間的增大，酶解產(chǎn)物的奶香味先增強(qiáng)后減弱；而隨著底物濃度的增大，酶解產(chǎn)物的奶香味也是先增強(qiáng)后減弱，且其增幅較酶解時(shí)間的增幅大，說(shuō)明，底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響較酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響顯著。

圖1 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線圖Figure 1 Response surface and contour plots showing pairwise interactive effect of enzymolysis temperature and enzymolysis time on sensory score of enzymatic product

圖2 酶解溫度和pH對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線圖Figure 2 Response surface and contour plots showing pairwise interactive effect of enzymolysis temperature and pH on sensory score of enzymatic product

圖3 酶解時(shí)間和底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線圖Figure 3 Response surface and contour plots showing pairwise interactive effect of enzymolysis time and substrate concentration on sensory score of enzymatic product

圖4 酶解溫度和底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線圖Figure 4 Response surface and contour plots showing pairwise interactive effect of enzymolysis temperature and substrate concentration on sensory score of enzymatic product

（4）酶解產(chǎn)物感官評(píng)分隨酶解溫度和底物濃度的變化：由圖4可知，在酶解時(shí)間為3.50h，酶解體系pH為8.00的情況下，隨著酶解溫度的增大，酶解產(chǎn)物的奶香味先增強(qiáng)后減弱；而隨著底物濃度的增大，酶解產(chǎn)物的奶香味也是先增強(qiáng)后減弱，且其增幅較酶解溫度的增幅小，說(shuō)明酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響較底物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響顯著。

綜上所述，酶解體系pH與酶解溫度的變化相對(duì)酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的影響最顯著，且影響的主次順序?yàn)閜H＞酶解溫度＞底物濃度＞酶解時(shí)間。根據(jù) Design－Expert 7.0.0軟件對(duì)本試驗(yàn)酶解產(chǎn)物的感官評(píng)分結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化統(tǒng)計(jì)分析，最終確定本試驗(yàn)的最佳酶解條件為酶解溫度61.0℃，酶解時(shí)間3.60h，pH 7.92，底物濃度36.0%，在此條件下預(yù)測(cè)到試驗(yàn)中酶解產(chǎn)物的感官評(píng)分為9.10。根據(jù)模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行近似驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)定，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到酶解產(chǎn)物的感官評(píng)分為9.50，且酶解產(chǎn)物奶香味濃郁、香氣純正、愉悅度好，與預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié)論

試驗(yàn)首先通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了酶添加量、乳化劑種類、乳化劑使用量、底物濃度、pH、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)物奶香味的影響。并進(jìn)一步結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到影響酶解產(chǎn)物感官評(píng)分的4個(gè)主要影響因素的主次順序?yàn)閜H＞酶解溫度＞底物濃度＞酶解時(shí)間。根據(jù)Design－Expert 7.0.0軟件對(duì)本試驗(yàn)中酶解產(chǎn)物的感官評(píng)分結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化統(tǒng)計(jì)分析，確定最佳的酶解條件為酶解溫度61.0℃、酶解時(shí)間3.60h、反應(yīng)體系的pH 7.92、底物濃度36.0%，此條件下得到的酶解產(chǎn)物奶香味濃郁、奶香純正、愉悅度好。

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