彭金龍 毛 健， 姬中偉 黃桂東 謝廣發(fā) 鄒慧君

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000）

黃酒為世界三大古酒之一，源于中國，唯中國有之，因其富含糖類、氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、多酚、微量元素、酯類等成份，且易被人體消化吸收，被譽為“液體蛋糕”［1－3］。千百年來，黃酒主要是采用傳統(tǒng)的陶缸、陶壇作為發(fā)酵容器進行的手工作坊式生產(chǎn)［4，5］。但是傳統(tǒng)的依靠自然氣候條件發(fā)酵生產(chǎn)黃酒的過程，很難控制，從而造成了黃酒產(chǎn)量增長速度緩慢、各批次品質(zhì)差異較大，這使得機械化大罐生產(chǎn)黃酒成為黃酒生產(chǎn)工藝革新的必然趨勢［6］，然而大罐生產(chǎn)黃酒的關(guān)鍵技術(shù)還未被完全突破。

發(fā)酵動力學是對試驗過程進行定量分析，對試驗指標進行較為準確的預測［7］，對發(fā)酵過程放大及從分批發(fā)酵過渡到流加發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵有著重要指導作用的過程，目前在葡萄酒［8］、醋［9］、秈米酒［10］、櫻桃果酒［11］等生產(chǎn)中已得到了廣泛應用。本試驗基于對黃酒發(fā)酵過程中的化學反應、菌體的新陳代謝機理等的研究，建立黃酒發(fā)酵的動力學方程，這將有利于更準確的掌握、了解黃酒發(fā)酵過程的各重要參數(shù)，對實現(xiàn)黃酒發(fā)酵自動化具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糯米：購于江蘇無錫；

麥曲：浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；

活性干酵母：安琪酵母公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：FA204N型，上海精密科學儀器有限公司；

離心機：4K15型，德國Sigma公司；

恒溫水浴鍋：HH－S2系列，江蘇金壇環(huán)宇科學儀器廠；

分光光度計：722S型，上海精密科學儀器有限公司；

精密pH計：PHS－3C型，上海精密科學儀器有限公司；

酒度計：浙江余姚黃家埠玻璃儀表廠；

電熱鼓風干燥箱：HG101－2型，南京實驗儀器廠；

全自動控制黃酒專用發(fā)酵罐：BIOTECH 10L型，上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 黃酒的釀造工藝

按照機械化釀造黃酒的工藝釀造黃酒［12］，發(fā)酵罐中投料量按照5L發(fā)酵罐配比投料（10L發(fā)酵罐投料相對5L放大1倍）：糯米投料量1kg（室溫浸米24h后蒸飯），釀酒用活性干酵母2g（用2g蔗糖，100mL蒸餾水，40℃活化40min，確保初始酵母菌數(shù)的數(shù)量為107個／g），加水1.5L（包括700mL米漿水），曲170g（原料米的17%）。前酵溫度為30℃，后酵溫度為15℃。前酵每隔12h取1次樣，后酵每隔24h取1次樣，測定殘?zhí)菨舛?、酒精度和菌體生物量。

1.4 檢測方法

向發(fā)酵罐中沖入無菌空氣將黃酒醪液混勻后，從發(fā)酵罐中取250mL醪液，測定殘?zhí)菨舛?、酒精度和菌體生物量。按照林巧等所述的細胞干重法［11］測定菌體生物量：10mL黃酒醪液3 000r／min離心3min后，上層液體再1 000r／min離心10min，倒去上清液待用，沉淀物（菌體）于105℃烘干至恒重后稱量；另取240mL黃酒發(fā)酵醪液，用雙層紗布過濾后，濾液3 000r／min離心5min，將離心后的上清液按照GB／T 13662——2008［13］中所述的亞鐵氰化鉀滴定法和蒸餾法測定殘?zhí)菨舛群途凭取?/p>

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用 Matlab，結(jié)合csape、nlinfit、ppval、fnder軟件，根據(jù)試驗所得數(shù)據(jù)，對酵母生長動力學方程、酒精生成動力學方程和底物糖消耗動力學方程進行非線性回歸，求解出模型的參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒發(fā)酵過程主要物質(zhì)變化曲線

將釀造黃酒所有原輔料投入到10L發(fā)酵罐中，按照機械化釀造黃酒工藝釀造黃酒，測定殘?zhí)菨舛取⒕凭群途w生長量，所得黃酒發(fā)酵過程主要物質(zhì)變化曲線見圖1。

圖1 黃酒發(fā)酵過程主要物質(zhì)變化曲線Figure 1 Metabolic curves of fermentation process of Chinese rice wine

由圖1可知，酵母菌的生長速度很快，接種后不久便開始進入對數(shù)生長期。當酵母菌發(fā)酵至4d后菌體生長進入了穩(wěn)定期，此時菌體生物量達到最高值20.34g／L；7d后，黃酒發(fā)酵液中菌體細胞進入衰亡期，細胞生長環(huán)境惡化，活細胞死亡率增加，細胞濃度迅速降低。對于產(chǎn)物酒精，其產(chǎn)量在前5d內(nèi)快速增長；5d后黃酒發(fā)酵進入后發(fā)酵期，發(fā)酵溫度降為15℃，酵母產(chǎn)酒精也變得緩慢。體系中的總糖因維持菌體生長，形成產(chǎn)物，維持細胞呼吸新陳代謝作用而不斷消耗，因此不斷減小。

2.2 菌體生長動力學模型的建立

由于黃酒生產(chǎn)周期長，菌體生長可明顯分為前期（生長期及穩(wěn)定期）和后期（衰亡期）兩個階段，因此采用分段函數(shù)對菌體生長狀況進行描述。

（1）發(fā)酵前期：Logistic模型是一個典型的S形曲線方程，廣泛應用于發(fā)酵的細胞生長過程［14］，能夠較好地反映發(fā)酵過程中由于細胞濃度增加對其自身所產(chǎn)生的抑制效應。根據(jù)黃酒發(fā)酵特點，選用Logistic模型描述菌體細胞前期的生長情況，求解各參數(shù)：

式中：

X—— 菌體濃度，g／kg·醪液；

μm—— 最大比生長速率，h－1；

Xm—— 最大菌體濃度，g／L。

對式（1）兩邊積分得式（2）：

根據(jù)發(fā)酵過程中的試驗數(shù)據(jù)，X0＝7.37，Xm＝20.34及估算值μm＝0.135，結(jié)合Logistic模型，使用Ode45，對微分方程（2）擬合求解得到X0＝7.00，Xm＝20.29及μm＝0.277，并代入方程（2），得：

（2）發(fā)酵7d后，菌體細胞進入衰亡期，在衰亡期細胞生長環(huán)境惡化，活細胞死亡速率增加，細胞濃度迅速降低，在此不作考慮。

2.3 酒精生成模型

黃酒發(fā)酵過程中，酒精是酵母細胞代謝的產(chǎn)物，基于此理論，酒精的形成模型應該與菌體的質(zhì)量濃度相關(guān)。由此，可采用較為通用的由 Luedeking R 和 Piret EL［15，16］于1959年所提出的數(shù)學模型：

式中：

α——生長相關(guān)系數(shù)；

β——非生長相關(guān)系數(shù)；

p—— 產(chǎn)物濃度，g／L；

對于酒精生成過程是與酵母生長相關(guān)的過程，因此黃酒發(fā)酵過程顯然屬于產(chǎn)物部分偶聯(lián)型（α≠0，β≠0）的相關(guān)模型。式（4）兩邊積分得式（5）：

通過軟件擬合得到生長相關(guān)系數(shù)α＝66.10，代入式（5）得到產(chǎn)物生成動力學模型公式：

2.4 底物糖消耗模型

黃酒發(fā)酵過程中，底物消耗模型應從底物消耗的3個部分來考慮：形成產(chǎn)物，供給菌體生長，維持細胞呼吸新陳代謝作用［17］?；诖嗽?，黃酒發(fā)酵過程中底物糖消耗模型的建立形式為：

式中：

Yx／s—— 菌體對底物的得率系數(shù)；

Yp／s—— 酒精對底物的得率系數(shù)；

m—— 維持系數(shù)，h－1；

S—— 底物濃度，g／L；

底物在細胞內(nèi)合成產(chǎn)物的模型取決于產(chǎn)物的生成是否與能量代謝過程相偶聯(lián)。當產(chǎn)物的生成是以產(chǎn)能途徑進行時，則由于細胞生長和維持能，生成產(chǎn)物則是不可避免的，此時無單獨底物流入細胞用于生成產(chǎn)物，而所生成產(chǎn)物所消耗的底物來自于用于生長和維持能的底物，并且消耗于維持能的底物對細胞生長無作用。對于酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精這一生理過程，生產(chǎn)酒精所消耗的底物來自于細胞生長維持能的底物，此時產(chǎn)物的生成直接與能量的生產(chǎn)相聯(lián)系，因此底物的消耗速率方程不包括單獨的產(chǎn)物生成項，可將原方程化簡為：

上式兩邊積分得：

黃酒發(fā)酵過程中，以殘?zhí)呛孔鳛榈孜锵闹笜?，通過擬合得到模型參數(shù)初始底物濃度S＝107.7，底物的細胞生長得率系數(shù)Yx／s＝0.066 9、維持系數(shù)m ＝0.193，代入上式得到底物消耗模型為：

2.5 模型驗證

按照機械化釀造黃酒的工藝條件，進行黃酒分批發(fā)酵的重復試驗，將分批發(fā)酵所得的實驗值與上述參數(shù)代入后得到的動力學模型預測的理論值進行比較，結(jié)果見表1。比較發(fā)現(xiàn)：用動力學模型擬合分批發(fā)酵過程除極個別點外，大部分數(shù)據(jù)點的誤差均小于10%，發(fā)酵終點的糖含量誤差很大，可能是由亞鐵氰化鉀滴定法帶來的誤差，而且殘?zhí)菨舛然窘咏诹?，可舍去該點。菌體生長、產(chǎn)物形成和底物消耗的平均相對偏差分別為8.88%、3.45%和1.58%，表明所擬合的動力學模型較好地反映了實際的發(fā)酵過程。

表1 動力學模型計算值與實驗值的比較Table 1 Error proof of Dynamics model of pullulan fermentation

3 結(jié)論

本研究分別采用Logistic方程與Luedeking R經(jīng)驗方程描述酵母的生長與酒精合成、底物消耗過程，建立了黃酒發(fā)酵過程中菌體生長模型、酒精生成模型和底物糖消耗模型，并對模型加以驗證。

通過對黃酒發(fā)酵動力學的研究，進一步了解了黃酒發(fā)酵過程中微生物生理特征，發(fā)酵過程中底物消耗和產(chǎn)物形成的規(guī)律，以及各參數(shù)之間的關(guān)系，為黃酒發(fā)酵過程工藝控制和黃酒大罐發(fā)酵的設(shè)計提供了理論基礎(chǔ)。

1 傅金泉.黃酒生產(chǎn)技術(shù)［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2005：1～3.

2 王存厚.談黃酒派生出的料酒及作用［J］.中國酒，2002（6）：62～63.

3 Legras J，Merdinoglu D，Cornuet J，et al.Bread，beer and wine：Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history［J］.Molecular Ecology，2007，16（10）：2 091～2 102.

4 周恒剛.古今釀酒與陶器［J］.釀酒科技，2000（5）：31～32.

5 Bautista－Ortin A，Lencina A，Cano－Lopez M，et al.The use of oak chips during the ageing of a red wine in stainless steel tanks or used barrels：effect of the contact time and size of the oak chips on aroma compounds［J］.Australian Journal of Grape and Wine Research，2008，14（2）：63～70.

6 梁慶華.黃酒弱勢逆轉(zhuǎn)須抓準7個關(guān)鍵點［N］.中國食品報，2010－01－06（007）.

7 Phisalaphong M，Nuttapan S，Tanthapanichakoon W.Mathematical modeling to investigate temperature effect on kinetic parameters of ethanol fermentation［J］.Biochemical Engineering Journal，2006（28）：36～43.

8 Mannazzu I，Angelozzi D，Belviso S，et al.Behaviour of Saccharomyces cerevisiae wine strains during adaptation to unfavourable conditions of fermentation on synthetic medium：Cell lipid composition，membrane integrity，viability and fermentative activity［J］.International Journal of Food Microbiology，2008（21）：84～91.

9 De Ory I，Romero L，Cantero D.Optimum starting－up protocol of a pilot plant scale acetifier for vinegar production［J］.Journal of Food Engineering，2002，52（1）：31～37.

10 劉小翠，趙思明，王蓮.秈米甜酒的發(fā)酵動力學及工藝優(yōu)化［J］.食品科學，2007，28（12）：263～267.

11 林巧，李燕紅，孫小波，等.櫻桃果酒發(fā)酵動力學研究［J］.中國釀造，2007（7）：65～67.

12 李家壽.黃酒釀造工藝［M］.北京：中國釀酒工業(yè)協(xié)會黃酒分會編印，2004：147～150.

13 全國食品工業(yè)標準化技術(shù)委員會釀酒分技術(shù)委員會.GB／T 13662——2008黃酒［S］.北京：中國標準出版社，2008.

14 Ikasari L，Mitchell D.Two－phase model of the kinetics of growth of Rhizopusoligosporus in membrane culture［J］.Biotechnol.Bioeng，2000（68）：619～627.

15 Luedeking R，Piret E L.A kinetic study of the lactic fermentation［J］.Jornal of BiochemIcal and Microbiological Technology and English，1959（1）：393～430.

16 Berry A，F(xiàn)ranco C，Zhang W.Growth and lactic acid production in batch culture of Lactobacillus rhamnosus in a defined medium［J］.Biotechnology Letters，1999（21）：163～167.

17 張中義，張勇，孫君社.植物乳桿菌合成CLA發(fā)酵動力學研究［J］.食品與機械，2007（5）：7～10.