鄭曉燕 張良成 周琳瑛 高美欽 郭永正

·實驗研究·

大鼠腦缺血再灌注對白質的損傷作用

鄭曉燕 張良成 周琳瑛 高美欽 郭永正

目的 觀察和評價大鼠腦缺血再灌注誘發(fā)白質少突膠質細胞和髓鞘的損傷變化。方法按照隨機原則將實驗動物隨機分為假手術組(10只), 再灌注3 d組(15只)。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion reperfusion, MCAO/R)模型, 應用免疫組織化學染色檢測髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)的表達與分布；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d-UTP切口末端標記技術(TdT2-ediated d-UTP nickend labeling technique, TUNEL法)檢測凋亡細胞。結果 腦缺血再灌注后, 動物均表現(xiàn)為神經(jīng)行為功能障礙；與假手術組相比, 患側腦白質MBP陽性分布減少, 可見多量凋亡細胞。 結論 腦缺血再灌注可對腦白質造成顯著損傷, 表現(xiàn)為少突膠質細胞的凋亡, 以及髓鞘的損傷。

腦缺血；再灌注損傷；少突膠質細胞；髓鞘；髓鞘堿性蛋白

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦病中危及生命的重要病理過程。近年來, 隨著分子生物學和影響技術的發(fā)展, 腦白質缺血性損傷這種常見的臨床現(xiàn)象逐漸受到人們的重視。腦白質的損傷可破壞神經(jīng)元之間、皮質和皮質下中樞之間的型號傳遞, 也可造成其神經(jīng)纖維投射區(qū)的灰質損傷, 是急性缺血性腦損傷后部分神經(jīng)功能恢復緩慢或難以恢復的原因之一［1,2］。有髓鞘的神經(jīng)纖維是腦白質的重要組成部分, 髓鞘正常結構的維持對軸突快速電傳導、神經(jīng)元之間的聯(lián)絡等功能起重要作用。本文重點觀察腦缺血再灌注損傷后腦白質少突膠質細胞及神經(jīng)纖維髓鞘的變化, 目前國內有關這方面的報道較少。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠25只, 體重(250±20) g由上海實驗動物中心提供［SCXK(滬) 2007-0005］。

1.2 主要試劑和材料 羊抗大鼠MBP抗體(購于美國Santa Cruz公司), Tunel試劑盒(購于德國Roche分子生物化學制品公司), SP試劑盒(購于福州邁新公司), 3,3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯示劑(購于福州邁新公司), 尼龍線栓(購于北京沙東生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的制備及分組 按照隨機原則將實驗動物隨機分為假手術組(10只)、再灌注3 d組(15只)。假手術組除不插入線栓外, 其余操作同再灌注組。再灌注組大鼠采用線栓法建立MCAO/R模型。

1.3.2 神經(jīng)功能學評分 參考Longa的5級4分標準進行神經(jīng)功能學評分。1~4分為有效模型。

1.3.3 組織切片制備 假手術組、再灌注組各取10只, 深度麻醉后快速斷頭取腦, 取自視交叉平面后的厚約2 mm冠狀切片, 制成5 μm厚度的切片, 貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上, 分別用于免疫組化染色和凋亡細胞原位檢測。

1.3.4 免疫組化染色 取上述切片常規(guī)脫蠟水化, 3%過氧化氫去除內源性過氧化物, 正常雞蛋清封閉, 滴加一抗, 37 ℃濕盒過午, 滴加二抗, 室溫作用20 min, 滴加酶標記體, DAB顯色, 蘇木素復染, 中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.3.5 凋亡細胞原位檢測 取上述切片常規(guī)脫蠟水化, 經(jīng)雙蒸水沖洗后, 按照Tunel試劑盒說明操作, DAB顯色, 蘇木素復染, 中性樹膠封片后光鏡下觀察。

2 結果

2.1 神經(jīng)行為功能評分 假手術組10只大鼠術后均存活,除部分出現(xiàn)Horner征外, 未見神經(jīng)行為功能異常。再灌注3 d組15只大鼠術后存活12只, 其中Longa評分1分的有3只, 2分的5只, 3分的4只, 均為有效模型。死亡的3只大鼠,尸體解剖可見大腦蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦組織高度水腫, 提示其死因為顱內血管破裂或高顱內壓。

2.2 MBP免疫組織化學改變 假手術組大鼠腦白質可見MBP陽性分布, 陽性信號較強, 常成簇分布, 左右大腦半球對稱分布。再灌注3 d組健側大鼠腦MBP陽性信號與假手術組相同(圖1.A), 患側MBP染色彌散, 陽性反應少于假手術組, MBP表達稀疏(圖1.B)。

2.3 凋亡細胞原位檢測 光鏡下, 凋亡細胞的胞核被標記上棕黃色, 正常細胞的胞核為藍色。假手術組和再灌注3 d組健側腦白質沒有觀察到凋亡細胞(圖2A), 患側大腦白質可見多量凋亡的細胞(圖2.B)。

HE染色, ×40。右上為局部放大圖, 再灌注3 d組右側腦白質浸潤的炎癥細胞(→), HE染色, ×200。TEM×8000。TEM×10000。

3 討論

有髓鞘包裹的神經(jīng)纖維是大腦白質的重要組成部分。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘由少突膠質細胞延伸的胞質膜所構成, 這些細胞由胞質膜發(fā)出“帆樣”突起, 每一個突起構成髓鞘的一個結間段, 突起呈螺旋狀纏繞軸突, 形成同心圓狀板層。本實驗應用Tunel法發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后患側腦白質有多量凋亡細胞。這與缺血再灌注后肝細胞的損傷變化一致［3］。目前缺血再灌注后少突膠質細胞發(fā)生這些病理變化的原因還未闡明, 作者考慮與以下幾個因素有關。由于少突膠質細胞缺乏補體抑制蛋白, 容易受到炎癥因子的攻擊。腦缺血再灌注后,腦組織內IL-1, IL-6 和TNFα等促炎因子表達增多［4］。因此作者認為少突膠質細胞發(fā)生這些病理變化可能與MCAO/ R后這些促炎因子過度表達有關。此外, 髓鞘和少突膠質細胞表達NMDA和非NMDA型谷氨酸受體(后者包括AMPA受體和紅藻氨酸受體), 其過度興奮可導致髓鞘和少突膠質細胞變性［5］。有學者認為氧自由基以及細胞內細胞內Ca2+超載, 產生Ca2+依賴性細胞損傷也與腦缺血再灌注后白質損傷有關［6］。

MBP是髓鞘相關蛋白的主要成分, 由成熟的少突膠質細胞合成, 集中分布于有髓纖維束, 對髓鞘正常結構的形成及維持起重要作用。MBP合成不足的小鼠可出現(xiàn)軸突嚴重低髓鞘化, 已髓鞘化的軸突其髓鞘同心圓狀板層結構松弛, 喪失正常的致密結構［7］。缺血損傷后少突膠質細胞的髓磷脂相關基因表達受到持久抑制, 即使細胞始終存活, 髓鞘合成亦會逐漸減少。汪長勝等［8］認為由于髓磷脂分解和破壞具有較長的半衰期(2.5~8.7 d), 髓鞘損傷多發(fā)生在缺血后10~14 d。而本實驗中, MCAO 2 h后再灌注3 d組的大鼠, 患側腦白質廣泛性MBP染色彌散, 局部可見MBP染色缺失, 與Tanaka K等［9］觀察結果相似。這差異可能與缺血程度、缺血時間、及再灌注損傷有關。

髓鞘的破壞作者認為至少有兩方面的原因, 一方面由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘是由少突膠質細胞膜盤繞而成的, 因此少突膠質細胞的病變必然引起髓鞘合成減少或脫髓鞘改變。另一方面軸索的破壞也是引起髓鞘病變的一個重要原因。目前軸索破壞的相關機制還未完全闡明, 作者認為雖然軸突缺乏興奮性氨基酸受體, 但非突觸的細胞機制亦可介導缺血再灌注損傷, 損傷的軸突釋放大量興奮性氨基酸, 通過受體機制可加重少突膠質細胞的損傷。作者將在后續(xù)的實驗中繼續(xù)研究。

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350001 福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科(鄭曉燕 張良成 郭永正)；福建醫(yī)科大學病理學系(周琳瑛 高美欽)

張良成