胥 文

山東省萊蕪鋼鐵集團有限公司醫(yī)院檢驗科，山東萊蕪 271126

大量的臨床研究報道證實人乳頭瘤病毒（HPV）是導(dǎo)致女性宮頸癌和癌前病變的主要病毒，調(diào)查顯示宮頸癌患者的標(biāo)本HPV檢出率已經(jīng)超過了90%，因此做好人乳頭瘤病毒的檢查診斷對宮頸疾病的預(yù)防和治療有著極其重要的臨床價值[1]。國際癌癥組織對世界多個國家地區(qū)的宮頸癌進行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)該類病毒主要有15種高危型DNA，HPV16、HPV18和HPV58是我國最為常見的三種高危型病毒[2]。目前第二代雜交捕獲法是檢測HPV的主要方法，隨著生物技術(shù)的進步發(fā)展，實時熒光PCR技術(shù)的出現(xiàn)為DNA的臨床檢測提供了簡便和快捷。本次研究主要對第二代雜交捕獲法和實時熒光PCR的檢測結(jié)果進行了比較分析，以期為臨床診斷HPV提供參考，現(xiàn)總結(jié)如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象

隨機選取2010年10月～2011年10月于本院婦產(chǎn)科接受診治的人乳頭瘤病毒感染患者102例，年齡24～60歲，平均（34.8±2.6）歲；臨床細(xì)胞檢查結(jié)果：低度鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)病變患者40例，高度鱗狀上皮內(nèi)病變患者16例，不典型鱗狀細(xì)胞46例；所有患者均無其他嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)疾病，本次檢查已征得患者的同意。

1.2 試劑和儀器

本次試驗所用的主要試劑盒器材如下：美國Digene公司提供HPV-DNA試劑盒、HCⅡ基因雜交信號擴大系、子宮頸采樣器，Xygen公司提供的微孔板封面膠膜和圓底96孔酶標(biāo)板；上海復(fù)星診斷公司提供的高危型HPV實時熒光PCR試劑盒和實時熒光PCR儀（Line-Gene FQIN33 A型）。

1.3 試驗方法

采取對照性試驗進行分析探討，分別使用第二代雜交捕獲法（HCⅡ）和實時熒光PCR對102例患者的標(biāo)本進行檢測，結(jié)合患者的病理資料對兩種檢測方法的結(jié)果進行比較分析。

1.4 檢測方法

1.4.1 第二代雜交捕獲檢測 本方法可對13種高危型HPV進行同步檢測，根據(jù)試劑盒說明書進行相應(yīng)的試驗操作，首先是對標(biāo)本DNA解鏈，將解鏈后的單鏈DNA與RNA探針雜交，得到DNA-RNA的雜交體，雜交體可同微孔壁特異性抗體進行結(jié)合，磷酸化抗體后信號放大，底物經(jīng)堿性磷酸酶作用后發(fā)光，通過發(fā)光的強弱來對微孔壁上磷酸酶含量進行測定，最后獲得特異性結(jié)合雜交體含量。如果HPV負(fù)荷量超過1.0 pg/mL則可判定為發(fā)生 HPV陽性感染。

1.4.2 實時熒光PCR檢測 不同探針和引物（3'端和5'端分別標(biāo)有熒光淬滅基團和熒光報告基團）需要在特異性堿基區(qū)和模板作用，Taq酶能夠?qū)⑻结樈到?，此時熒光報告基團可以擺脫熒光淬滅基團，增強熒光信號，通過定量PCR儀動態(tài)檢測標(biāo)本熒光信號，確定其型別。實時熒光PCR劑盒也可對13種高危型HPV型進行檢測，其操作流程主要根據(jù)試劑盒說明書實施，大概步驟：樣本DNA的提取-實時熒光PCR反應(yīng)液的配置-樣本實時熒光PCR擴增和檢測-根據(jù)熒光值判定反應(yīng)結(jié)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料用±s表示，采用t檢驗或χ2檢驗對相關(guān)數(shù)據(jù)進行比較分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同程度宮頸病變的HPV陽性檢出率

病理資料顯示本組病例中宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）的有38例，慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的36例，HCⅡ和實時熒光PCR對CIN的HPV陽性檢出率分別為86.84%和94.74%，對慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的陽性檢出率分別為36.11%和58.33%，具體比較情況見表1。

表1 兩種方法不同程度宮頸病變的HPV陽性檢出率比較[n（%）]

2.2 HPV的陽性檢出率和符合率

HCⅡ的HPV總陽性檢出率為62.75%，實時熒光PCR的為71.57%，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.46，P＜0.05），兩種方法的總符合率為82.35%，具體比較情況見表2。

表2 兩種方法的陽性檢出率比較

2.3 CIN的臨床檢測

根據(jù)患者的病理檢查結(jié)果對CINⅡ和CINⅢ的檢測結(jié)果進行比對發(fā)現(xiàn)兩種手段在高危型宮頸病變的檢測具有較好的相關(guān)性，實時熒光PCR的靈敏性和特異性要略好于HCⅡ。

3 討論

3.1 人乳頭瘤病毒

目前的臨床研究[3-4]發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒基因型有100余種，和生殖道感染相關(guān)的占到了40%，和腫瘤發(fā)生相關(guān)的占了20%，根據(jù)其致病能力的異同可將該類病毒分為高危型病毒和低危型病毒，該病毒和女性宮頸癌的發(fā)生有著極為密切的關(guān)系。低危型病毒可能導(dǎo)致濕疣和宮頸上皮內(nèi)發(fā)熱低度病變，高危型人乳頭瘤病毒具有較高的致癌能力，主要包括HPV16、HPV18，已有的一些研究已經(jīng)證實宮頸癌組織標(biāo)本該類病毒的陽性檢出率超過90%，因此做好其診斷檢查對臨床治療具有重要的意義[5]。

3.2 兩種檢測方法

臨床研究[6-7]證實第二代雜交捕獲檢測對HPV具有較好的臨床檢測效果，隨著醫(yī)療診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和進步，實時熒光PCR技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床檢測。本研究對第二代雜交捕獲檢測和實時熒光PCR技術(shù)的檢測結(jié)果進行了比較，兩者的符合性達到82.35%，結(jié)果證明兩種手段在高危型宮頸病變的檢測具有較好的相關(guān)性；實時熒光PCR的靈敏性和特異性要略好于第二代雜交捕獲檢測，本次研究結(jié)果中實時熒光PCR總陽性檢出率也要顯著好于第二代雜交捕獲檢測，且對慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的HPV的檢測效率要顯著好于第二代雜交捕獲檢測，這些結(jié)果說明此種檢測方法對于臨床檢測和診斷HPV具有較好的效果，可以作為一種有效的檢測手段來對此種病毒診斷，實時熒光PCR的操作簡便有效，在縮短檢測時間的同時，大大提高了對人乳頭瘤病毒的診斷的有效性[8]。

綜上所述，實時熒光PCR和第二代雜交捕獲法都是臨床上檢測人乳頭瘤病毒的有效方法，兩者的HPV診斷相關(guān)性較高，實時熒光PCR具有較好的靈敏性和特異性，提高了診斷準(zhǔn)確性，為宮頸類疾病的早發(fā)現(xiàn)和治療提供了可靠的依據(jù)。

[1]沈云岳，劉華，王蕾，等.實時熒光PCR和HC-Ⅱ檢測高危型人乳頭瘤病毒的臨床價值[J].山東醫(yī)藥，2010，50（5）：77-78.

[2]胡靜云.實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測人乳頭瘤病毒高危亞型的臨床應(yīng)用[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，26（5）：767.

[3]徐平，章曉鷹，張慧敏.SYBR Green實時熒光PCR方法檢測廣譜人乳頭瘤病毒的方法建立[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（7）：734-735.

[4]賈政軍，周玉春，胡蓉，等.HPV mRNA實時熒光定量PCR檢測及其與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，19（3）：354-358.

[5]杜娟，李曉強，劉躍.高危人乳頭瘤病毒檢測在實時多重?zé)晒夂怂釘U增技術(shù)中的意義[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（4）：460-461.

[6]王鶴，于繼云，李力.實時熒光定量PCR檢測宮頸癌患者HPV病毒負(fù)載量的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，29（2）：232-235.

[7]程嬌影，卞美璐，馬莉，等.實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測宮頸人乳頭瘤病毒在宮頸癌篩查中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2011，33（3）：345-347.

[8]王立鋒.宮頸人乳頭瘤病毒第二代雜交捕獲法和實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測法的臨床應(yīng)用比較 [J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（36）：92-94.