龔志剛 宋春暉 石向群

1.江西師范大學(xué)體育學(xué)院，江西南昌 330022；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330022；3.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西九江 332000

降鈣素基因相關(guān)肽 （calcitonin gene-related peptide，CGRP）是1983年由國外學(xué)者Rosenfeld MG等[1]發(fā)現(xiàn)的一種具有復(fù)雜生物功能的活性多肽，是迄今為止所知的體內(nèi)最強的內(nèi)源性舒血管多肽，CGRP與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。許多研究證實，糖尿病患者血漿CGRP水平降低，且在合并糖尿病腎病時降低更明顯[2-4]。本文擬結(jié)合葛根素（puerarin）防治糖尿病的作用機理，通過對糖尿病腎病大鼠腹腔注射葛根素注射液，來觀察葛根素對血漿中CGRP的影響，為DN的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

葛根素注射液 （黑龍江哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司提供，國藥準字 H20044142，批號：2010-03-12）；鏈尿佐菌素（STZ，美國Sigma公司），臨用前用檸檬酸緩沖液配成l%的STZ溶液；大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）試劑盒，內(nèi)皮素（ET）試劑盒，尿微量白蛋白（U-mAIb）試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 儀器

GC-911γ放射免疫計數(shù)器（中國科技大學(xué)創(chuàng)新股份有限公司）、DNM-9602型酶標儀 （北京普朗新技術(shù)有限公司）、HH-8數(shù)字顯示恒溫水浴箱 （常州國華儀器公司）、便攜式血糖儀（日本京都公司）、DT-1001電子天平（江蘇常州衡器廠）、低速大容量離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 動物

6周齡Sprague-Dawley雄性大鼠40只，由南昌大學(xué)實驗動物中心提供，平均體重（220.0±15.6）g，單籠喂養(yǎng)，室溫20℃，相對濕度 50%，1 d 中光照∶黑暗時間為 12 h∶12 h，自由攝食飲水。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物建模 40只大鼠預(yù)養(yǎng)一周后，隨機選取一組10只為正常對照組，剩余30只空腹12 h，腹腔注射1%STZ-檸檬酸鈉緩沖液35 mg/kg體質(zhì)量。對照組注射等量檸檬酸鈉緩沖液，依據(jù)72 h后尿糖+++～++++，尾靜脈采血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L者，確定模型建立。除去造模失敗及實驗過程中死亡大鼠，將糖尿病鼠22只納入本實驗。

1.4.2 分組 （1）正常對照組（CN組10只）：糖尿病鼠隨機分為；（2）糖尿病組（D 組 11 只）：（3）葛根素治療組（S 組11只），S組每只給予160 mg/kg/d葛根素注射液進行腹腔注射，CN組腹腔注射等容量0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)干預(yù)14周。

1.4.3 標本采集 第14周實驗終止時，各組大鼠在禁食的基礎(chǔ)上，用代謝籠收集24 h尿液，測定尿白蛋白含量，動物經(jīng)乙醚麻醉后心臟取血。測試生化指標：（1）空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）采用便攜式血糖儀測定；（2）尿微量白蛋白（urinary microalbumin，U-mAIb）采用 ELISA 法測定；（3）內(nèi)皮素（endothelin，ET）采用放免法測定；（4）降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）用放免法測定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組均數(shù)之間均用單因素方差檢驗（one-way ANOVA）進行差異性比較，其中P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠模型的建立

注射STZ后72 h，糖尿病組空腹血糖明顯升高 （P<0.01），空腹血糖均值達到19.51 mmol/L；葡萄糖耐量試驗：兩組大鼠禁食12 h后，按2 g/kg·BW葡萄糖進行灌胃，尾部微量取血，分別測0.5、1.0、2.0 h血糖。實驗組大鼠1 h血糖值達到高峰，2 h仍高；對照組0.5 h達到高峰，2 h恢復(fù)空腹水平，提示實驗組出現(xiàn)糖耐量異常，且實驗組大鼠空腹血糖≥16.7mmol，表明糖尿病大鼠造模成功。見表1。

表1 兩組大鼠血糖和葡萄糖耐量試驗結(jié)果（±s，mmol/L）

表1 兩組大鼠血糖和葡萄糖耐量試驗結(jié)果（±s，mmol/L）

注：與對照組比較，＃P<0.05，＃＃P<0.01

組別 空腹血糖 葡萄糖耐量試驗0.5 h 1 h 2 h對照組實驗組4.67±0.78 19.51±2.51＃＃7.82±1.29 27.31±2.53＃＃5.91±0.56 29.69±2.99＃＃5.06±0.40 24.02±3.57＃＃

2.2 葛根素干預(yù)對DN大鼠相關(guān)生化指標的影響

各組測得FBG、U-mAIb和ET值，D組和S組都較CN組顯著升高（P<0.05），經(jīng)過14周葛根素干預(yù)后，S組較D組顯著下降（P<0.05）；而血漿CGRP值，D組和S組較CN組顯著下降（P<0.05），且 S組較 D 組明顯升高（P<0.05）。見表2。

3 討論

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病時腎臟病理改變中只有腎小球硬化癥的全身微血管并發(fā)癥之一，主要病理特征是腎臟高灌注、高濾過、腎小球基底膜增厚和系膜細胞增生及細胞外基質(zhì)增生，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性硬化，出現(xiàn)蛋白尿、高血壓、水腫、腎衰竭等變化，現(xiàn)臨床上已認定U-mAIb是DN診斷的標準之一[5]。CGRP是目前已知在體內(nèi)作用最強的擴張血管活性多肽，其通過與腎臟血管床上CGRP受體結(jié)合，引起腎臟血管的舒張作用，且可抑制血管平滑肌細胞增殖，促進內(nèi)皮細胞的增殖與修復(fù)[6]。另外CGRP可使腎小球系膜細胞舒展，從而增加腎小球濾過面積及濾過率，對腎臟血管具有強大的保護作用[7]。CGRP和U-mAIb的聯(lián)合檢測可能作為DN的監(jiān)控指標。

表2 各組大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的變化（±s）

表2 各組大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的變化（±s）

注：與CN組比較，aP<0.05，與D組比較，bP<0.05

組別 只數(shù) FBG（mmol/L）U-mAIb（μg/min）ET（pg/mL）CGRP（pg/mL）CN組D組S組10 11 11 5.20±0.63 20.54±1.76*16.65±2.3*#14.87±5.65 169.77±40.56*124.32±48.78*#59.59±23.13 112.43±27.66*88.96±24.26*#276.51±76.77 178.99±45.44*226.76±64.88*#

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠U-mAIb升高，血漿CGRP降低，表明模型組已出現(xiàn)DN癥狀。DN體內(nèi)持續(xù)的高血糖導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷，使ET分泌增加。ET作為血管活性多肽均可與腎臟相應(yīng)受體結(jié)合，使腎小球毛細血管壓增加，從而導(dǎo)致尿蛋白漏出增加。而CGRP對ET具有生物學(xué)拮抗作用，已被學(xué)者證實[8]。

葛根素作為豆科葛根中提取的異黃酮類化合物，《本草綱目》記載其有生津止渴的功效，目前研究已證實葛根素對糖尿病有治療作用[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，葛根素能降低血液黏度，抑制血小板凝集，降低血漿ET、血管緊張素Ⅱ及腎素活性，從而擴張微動脈，改善腎小球的缺血、缺氧及高凝狀態(tài)[10]；同時還可清除糖基化反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基，提高機體抗氧化能力[11]。本實驗通過14周葛根素干預(yù)后，DM大鼠U-mAIb顯著減少，ET下降明顯，CGRP較模型組明顯增加，從而延緩DN發(fā)生發(fā)展的病理進程。崔秀玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)：DM模型組大鼠尿清蛋白排泄率顯著升高，且隨病程延長而增加，表明DM可以損傷腎小球，且隨病程的延長損傷加重。分別采用低、中、高劑量葛根素治療后，尿清蛋白排泄率較正常對照組有一定程度升高，但明顯低于中劑量組，提示葛根素對DM模型大鼠腎臟有較好的保護作用。本研究亦表明葛根素對DN有明顯的改善作用，其部分原因可能是通過提升CGRP的作用，拮抗或抑制ET的釋放，使腎臟血管舒張，改善微循環(huán)，減少U-mAIb的排放。但其具體的機制還待進一步研究。

[1]Rosenfeld MG，Mermod JJ， Amara SG，et al.Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing[J].Nature，1983，304（5922）：129-135.

[2]Helset E，Kjaeve J，Bjertnase L，et al.Acute alveolar hypoxia increase endothelin-1 releasebut decrease release of calcitonin gene-related peptide in isolated perfused rat lungs[J].Scand JCl in Lab Invest，1995，55（5）：369-376.

[3]胡玲，林小紅，張選均，等.血漿降鈣素基因相關(guān)肽與糖尿病微血管病變的關(guān)系[J].臨床心血管雜志， 1996，6（12）：383.

[4]王憲，孫威，刑立愚，等.糖尿病大鼠腸系膜動脈降鈣素基因相關(guān)肽釋放減少以及一氧化氮的作用[J].生理學(xué)報，1998，5（2）：206-211.

[5]Gross JL，Azevedo Mj，Silveiro SP， et al.Diabetic nephropathy： diagnosis， prevention，and treatment[J].Diabetic Care，2005，28（1）：164-176.

[6]Nozaki K，Okamoto S，Vemura Y，et al.Vaseular relaxation Proportion of Caleitonin gene-related Peptide and vasoaetive intestinal polypeptide in subarachnoid haemorrhage[J].J Neurosurg，1990，72：792-797.

[7]曹翠平.降鈣素基因相關(guān)肽、內(nèi)皮素與糖尿病腎病的關(guān)系及干預(yù)治療的臨床意義初探[D].沈陽.中國醫(yī)科大學(xué)，2004：30.

[8]Wang Y，Wang DH.Prevention of endothelin-1-induced increases in blood pressure：role of endogenous CGRP[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（4）：1868-74.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.廣州：廣東科技出版社，1995：297.

[10]蘇春暈.實用中藥藥理新編[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1997：179.

[11]龔志剛，朱篤，胡紅霞，等.葛根素對糖尿病大鼠血糖和抗氧化能力的影響[J].食品科學(xué)，2006，27（11）： 498-501.

[12]崔秀玲，王遠征，劉曉健.葛根素對糖尿病模型大鼠尿清蛋白排泄率的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，：29（2）：163-164.