方振敏,袁興中*,曾光明,韓增輝,郭靈芝,彭 馨,劉 薇,黃華軍 (1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410082)

環(huán)境中木質(zhì)素類物質(zhì)的大量存在使得木質(zhì)素降解酶的研究具有現(xiàn)實(shí)意義[1].木素過氧化物酶(Lip)被認(rèn)為是木質(zhì)素降解過程中的關(guān)鍵酶類[2],它是由具有木素降解功能的白腐真菌分泌的胞外酶[3],可以催化一系列酚型和非酚型的木素模型化合物.在這些模型化合物中,非酚型富含電子的芳香族化合物藜蘆醇(VA)被認(rèn)為是 Lip降解的最佳底物.在水溶液中,疏水性的木素模型化合物很難被親水性的 Lip有效降解[4],且酶分子構(gòu)象容易波動(dòng)而導(dǎo)致酶活性降低,因此尋求一種新的介質(zhì)體系來研究 Lip對(duì)疏水性化合物的降解具有重要意義.

反膠束是表面活性劑分子在有機(jī)溶劑中形成的納米級(jí)分子聚集體.在反膠束體系中,表面活性劑親水性頭基在內(nèi)形成的極性水核具有增溶生物大分子(如蛋白質(zhì)、酶等)的作用,外部的有機(jī)溶劑有助于疏水性化合物在其中的溶解.因此反膠束成為上述疏水性化合物酶法轉(zhuǎn)化的良好介質(zhì).近年來,反膠束體系作為酶催化反應(yīng)的介質(zhì)引起了越來越多的關(guān)注,但研究的重點(diǎn)卻偏向于化學(xué)表面活性劑構(gòu)建的反膠束體系[5-9].同化學(xué)表面活性劑相比,生物表面活性劑作為一種環(huán)境友好型的天然表面活性劑,具有低毒性、可生物降解性、生態(tài)相容性及一定的膠團(tuán)催化能力等優(yōu)勢(shì)[10],而在反膠束酶學(xué)中具有較好的應(yīng)用前景.目前,國(guó)內(nèi)外采用生物表面活性劑構(gòu)建反膠束體系進(jìn)行酶催化反應(yīng)的研究除了本課題組研究報(bào)道[11]外,幾乎未見其他報(bào)道.

本文以 Lip為生物催化劑,對(duì)比研究了單鼠李糖脂(RL)反膠束和膠束體系中 Lip催化氧化VA的各主要影響因素,同時(shí)探討了疏水性底物VA在非均相反膠束介質(zhì)中的分區(qū)系數(shù).該研究拓展了膠束酶學(xué)中用于構(gòu)建反膠束體系的表面活性劑的種類,這對(duì)于構(gòu)建適合于膠束酶學(xué)研究的新型反膠束體系(生物表面活性劑反膠束酶解體系)而言具有重大意義.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

島津 UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司),TDA-8002電熱恒溫水浴鍋,WHY-2恒溫水浴振蕩器,HZQ-C空氣浴振蕩培養(yǎng)箱,TGL-16G離心機(jī),磁力攪拌器.

藜蘆醇(VA)購(gòu)于 Sigma Aldrich公司.異辛烷、正己醇及實(shí)驗(yàn)過程中所用的其他試劑均為分析純,使用過程中無需進(jìn)一步純化,水為超純水.

1.2 鼠李糖脂的生產(chǎn)和純化

本實(shí)驗(yàn)所用的單鼠李糖脂由本課題組制備,其生產(chǎn)和純化步驟詳見文獻(xiàn)[12].

1.3 木素過氧化酶(Lip)的生產(chǎn)、分離和純化

木素過氧化酶(Lip)的生產(chǎn)、分離和純化步驟詳見文獻(xiàn)[13].

1.4 反應(yīng)初速度的測(cè)定

1.4.1 含有 Lip酶液的反膠束體系的制備 在小錐形瓶中加入一定體積的異辛烷-正己醇(體積比為1:1)的混合液,按照所需表面活性劑的濃度稱取一定量的鼠李糖脂于上述小錐形瓶中,用移液槍加入溶有一定量 Lip的檸檬酸緩沖液(0.1mol/L),pH 值梯度范圍為 3.0～4.2,磁力攪拌至形成透明澄清的反膠束體系.相應(yīng)的膠束體系只需將有機(jī)溶劑換成0.1mol/L的檸檬酸緩沖溶液.

1.4.2 反應(yīng)初速度的測(cè)定 VA是黃孢原毛平革菌的一種次生代謝產(chǎn)物,可誘導(dǎo)Lip的合成,是Lip的最適底物.在310nm處無光吸收,而在H2O2的協(xié)同作用下,Lip可以將 VA氧化成藜蘆醛,產(chǎn)物藜蘆醛在 310nm 處有強(qiáng)烈的光吸收[ε=9.3×103L/(mol·cm)][14].測(cè)試方法如下:直接稱取一定質(zhì)量的藜蘆醇溶于上述反膠束體系中,磁力攪拌均勻后,于30℃下預(yù)熱2min,取3mL于石英比色皿中,以 10mmol/L的 H2O2溶液引發(fā)反應(yīng),立即記錄310nm處吸光度A隨反應(yīng)時(shí)間t的變化曲線.反應(yīng)初速度ν0[μmol/(L·min)]即為A-t曲線線性部分的斜率.本實(shí)驗(yàn)在相同單因子條件下共設(shè)置了三組平行試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果為三次測(cè)定的平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 各主要因素對(duì)反應(yīng)初速度的影響

2.1.1 反應(yīng)體系的 pH值對(duì)ν0的影響 反應(yīng)介質(zhì)中的pH值是影響酶催化反應(yīng)的一個(gè)重要因素.通過配制一系列不同pH值梯度(3.0～4.2)的檸檬酸緩沖溶液(0.1mol/L),研究pH值對(duì)RL構(gòu)建的反膠束及膠束體系中Lip催化氧化VA反應(yīng)初速度的影響,其結(jié)果如圖1所示.一般而言,增溶的緩沖溶液的pH值被認(rèn)為是反膠束納米水核的pH值[15].納米水核的 pH值決定著酶分子的催化構(gòu)象及其在反膠束體系中的增溶能力,同時(shí) pH值的變化還可能改變酶分子與反膠束液膜之間的相互作用[16].

如圖 1所示,反膠束體系中催化反應(yīng)的最適pH值為3.8,這比在膠束水溶液(3.4)中的略高,這可能和Lip的結(jié)合和氧化位點(diǎn)有關(guān).Lip的結(jié)合和氧化位點(diǎn)暴露于酶蛋白的表面,當(dāng) Lip增溶到反膠束中后,其表面暴露的位點(diǎn)很容易受到 RL內(nèi)表面極性頭基的影響[17].由于反膠束反應(yīng)體系中的 pH 值低于 Lip的 pI:4.2～4.9[18],從而使得 Lip帶正電荷,這樣 RL液膜內(nèi)表面帶負(fù)電荷的陰離子頭基和帶正電的 Lip之間產(chǎn)生有利的靜電相互作用使得 Lip暴露的位點(diǎn)可以耐受相對(duì)較大的pH值.

圖1 pH值對(duì)鼠李糖脂反膠束和膠束體系中Lip氧化VA反應(yīng)初速度的影響Fig.1 Effect of pH on the initial reaction rate of VA oxidation by Lip hosted in the RL reverse micellar and micellar systems

2.1.2 表面活性劑溶度[RL]對(duì)ν0的影響 只有當(dāng)表面活性劑濃度達(dá)到臨界膠束濃度(cmc)時(shí)才能形成反膠束[19],單鼠李糖脂在水相及有機(jī)相中的臨界膠束濃度分別為0.012, 0.055mmol/L[20].依據(jù)上述cmc值,對(duì)比了兩種體系中[RL]對(duì)Lip催化VA反應(yīng)初速度的影響.由圖2可以看出,固定w0(c[水]/c[表面活性劑],無量綱)為 15.0 時(shí),在 RL構(gòu)建的反膠束體系中Lip催化氧化VA的反應(yīng)初速度隨著RL濃度的增加出現(xiàn)類似鐘型的變化趨勢(shì).[RL]在1～10cmc之間Lip的活力幾乎為零.在100～180cmc(約 5.5～10mmol/L)的范圍內(nèi),隨著[RL]的增大,催化活力逐漸增大.最大酶活出現(xiàn)在[RL]=10mmol/L處,超過 10mmol/L時(shí)隨著[RL]的增加酶活迅速降低.

在w0值恒定時(shí),表面活性劑濃度的增加只會(huì)引起反膠團(tuán)個(gè)數(shù)的增加而不會(huì)影響反膠團(tuán)體積的大小,開始階段由于反膠團(tuán)個(gè)數(shù)的增加增大了酶分子與底物的接觸和碰撞機(jī)率,因此反膠束酶系統(tǒng)中催化反應(yīng)速率隨著表面活性劑濃度的增加出現(xiàn)增大的趨勢(shì);超過一定值后,隨著RL濃度的增加,酶分子在反膠團(tuán)中的濃度降低,單位時(shí)間內(nèi)酶和底物的接觸機(jī)率變小從而又引起酶活的下降[21].而在鼠李糖脂構(gòu)建的膠束體系中 Lip催化VA反應(yīng)除了在低濃度30μmol/L下對(duì)Lip有微弱的激活作用外,從圖形的整體趨勢(shì)來看,膠束體系中Lip催化活力隨著RL濃度的增加而降低.對(duì)比可知,在膠束體系中較低的表面活性劑濃度即表現(xiàn)出對(duì) Lip催化活性的強(qiáng)烈抑制作用,這可能和水溶液中表面活性劑對(duì)酶蛋白的變性作用有關(guān).在膠束體系中,Lip分散于水溶液中,酶分子容易受到表面活性劑單體的變性作用,從而改變其催化構(gòu)象,導(dǎo)致催化活力的降低[22].

圖2 RL濃度對(duì)反膠束和膠束體系中Lip催化氧化VA反應(yīng)初速度的影響Fig.2 Effect of the concentration of RL on the initial reaction rate of Lip-catalyzed oxidation VA in the reverse micellar and micellar systems

2.1.3 含水率w0對(duì)ν0的影響 含水率w0直接影響反膠束納米水核大小,進(jìn)而影響反膠束增溶能力和酶在其中的催化效率[23].如圖 3所示,Lip催化氧化VA的反應(yīng)初速度隨著w0的變化呈現(xiàn)近似鐘型的變化趨勢(shì),w0在6.0以下Lip基本無催化活性(圖中略去),在w0為 6.0～15.0時(shí),隨著w0的增加催化反應(yīng)初速度逐漸增大,w0=15.0時(shí)催化速率達(dá)到最大值,之后隨著w0的增加催化速率幾乎成線性減小.

圖3 w0對(duì)RL反膠束體系中Lip氧化VA反應(yīng)初速度的影響Fig.3 Effect of w0 on the initial reaction rate of VA oxidation by Lip entrapped in the RL reverse micellar system

處于最佳含水率時(shí),反膠束納米水核空間的大小與酶分子大小相當(dāng),酶分子在反膠束中可以保持最佳的構(gòu)象,從而表現(xiàn)出較高酶活;當(dāng)w0小于此值時(shí),反膠束水核體積較小,不能很好地增溶酶分子,致使酶分子過多地暴露于有機(jī)溶劑中,從而使酶的催化活性降低;而當(dāng)w0大于此值時(shí),反膠束水核尺寸大于酶分子大小,酶分子在納米水核中的自由度增加,其構(gòu)象受到擾動(dòng)而變得松散.只有在最佳含水量時(shí)酶蛋白結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)剛性和熱力學(xué)穩(wěn)定性之間達(dá)到最佳平衡點(diǎn),酶才表現(xiàn)出最大活力[24].

2.2 Lip在兩種介質(zhì)中的活性和穩(wěn)定性

由于酶在增溶進(jìn)反膠束的過程中其活性和穩(wěn)定性會(huì)隨之改變[25],為此,實(shí)驗(yàn)測(cè)定并討論了Lip酶在RL膠束和反膠束體系中的催化活性和酶活穩(wěn)定性.膠束體系的實(shí)驗(yàn)條件:pH3.4,[RL]=0.012mmol/L,[H2O2]=2.45mmol/L;反膠束體系的實(shí)驗(yàn)條件:pH3.8,[RL]=10mmol/L,w0=15.0,[H2O2]=74μmol/L.由圖4可知,在RL膠束介質(zhì)中Lip酶活在8h內(nèi)損失超過50%,10h后Lip基本完全失活,而在RL反膠束體系中Lip的半衰期達(dá)到40h左右,在62h時(shí)仍然保持原有酶活的32%;此外,RL構(gòu)建的反膠束體系中Lip的最大催化活力比其在膠束水溶液中高了近2.86倍,表現(xiàn)出超活性.

圖4 Lip在兩種介質(zhì)中的活性和穩(wěn)定性Fig.4 Activity and stability of Lip in the two medium

圖5 H2O2濃度對(duì)RL反膠束及膠束體系中Lip催化氧化VA反應(yīng)初速度的影響Fig.5 Effect of the H2O2 concentration on the initial reaction rate of Lip-catalyzed oxidation VA in the RL reverse micellar and micellar system

在最優(yōu)催化條件下,酶在兩種體系中的活性和穩(wěn)定性產(chǎn)生較大差別的原因較為復(fù)雜,可能是因?yàn)镽L反膠束中的納米水核模擬了生物細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境,反膠束的存在使得增溶于納米水核中的 Lip與有機(jī)相彼此分離,避免了酶與有機(jī)溶劑的直接接觸,有效地保護(hù)了酶的活性部位,對(duì)其催化構(gòu)象的變化有一定程度的束縛作用,從而提高了酶的催化性能和穩(wěn)定性;而在膠束體系中,Lip分散于水溶液中,酶分子剛性減弱、波動(dòng)性變大,從而導(dǎo)致了活性降低[26-27].Kimura等[28]證實(shí)在AOT反膠束體系中, Lip酶由于受到反膠束納米水核的保護(hù)而導(dǎo)致 Lip的活性明顯增強(qiáng),類似現(xiàn)象出現(xiàn)在反膠束體系中錳過氧化物酶(Mnp)[29]、漆酶(Lac)[30]、纖維素酶(Cellulose)[31]、堿性磷酸酶(pNPPsase)[32]等的催化特性研究中.

2.3 H2O2抑制濃度和底物分區(qū)系數(shù)P的確定

2.3.1 H2O2抑制濃度的確定 對(duì)于Lip催化氧化VA的反應(yīng)而言,H2O2既是反應(yīng)的啟動(dòng)劑又是反應(yīng)的抑制劑[33],因此在討論膠束和反膠束中的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制時(shí)確定H2O2的抑制濃度十分必要.圖5表示在兩種介質(zhì)中反應(yīng)初速度隨著H2O2濃度的變化曲線.可以看出,反膠束體系中Lip的催化活性在很大程度上取決于 H2O2的濃度.當(dāng)H2O2濃度為74μmol/L時(shí)反應(yīng)初速度達(dá)到最大值,當(dāng)H2O2濃度達(dá)99μmol/L時(shí)即表現(xiàn)對(duì)酶活的強(qiáng)烈抑制作用,因此動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中 H2O2濃度范圍應(yīng)選擇在34～74μmol/L之間.然而在RL膠束水溶液中當(dāng)H2O2的濃度達(dá)到3.25mmol/L時(shí)Lip仍具有催化活性.在反膠束介質(zhì)中 H2O2的抑制濃度遠(yuǎn)低于水溶液中,主要是由反膠束介質(zhì)的微觀不均一性引起的.也就是說,在反膠束體系中,H2O2主要增溶于納米水核中,這高度濃縮了反應(yīng)過程中H2O2的濃度,從而使 H2O2在較低的濃度表現(xiàn)出對(duì)酶活的強(qiáng)烈抑制作用[34].

圖6 在一組不同θ下,在RL反膠束體系中Lip催化氧化VA反應(yīng)的初速度對(duì)VA濃度的雙倒數(shù)圖Fig 6 Double reciprocal plot of the initial rate of Lipcatalyzed oxidation VA versus the concentration of VA at several different values of θ in the RL reverse micellar system

2.3.2 VA在反膠束體系中分區(qū)系數(shù)P的確定 根據(jù)兩相模型(biphasic model)[35],將鼠李糖脂/異辛烷-正己醇/水反膠束體系看成由有機(jī)相和反膠束擬相兩部分組成.親水性的Lip酶增溶于反膠束擬相中,疏水性的底物VA在有機(jī)相和反膠束擬相中均有較大的溶解度[34].因此在討論 RL反膠束體系中Lip酶的催化動(dòng)力學(xué)時(shí)應(yīng)首先考慮VA在兩相中的分配系數(shù)P.由兩相模型(底物分區(qū)考慮在內(nèi)):

其中:kcat,app=kcat,mic

分配系數(shù)P定義如下:

式中:[E]0,app,[S]0,app為酶和底物的表觀初始濃度;kcat,app,kcat,mic為表觀催化常數(shù)和反膠束擬相催化常數(shù);km,app,km,mic為表觀米氏常數(shù)和反膠束擬相米氏常數(shù);θ為反膠束體系中水的體積分?jǐn)?shù);P為底物在反膠束擬相和有機(jī)相中的濃度比; [S]mic,[S]os為底物在反膠束擬相和有機(jī)相中的濃度.

由式(1)得:

由式(2)得:

由式(4)可知,在一組固定的θ下,產(chǎn)生幾個(gè)固定的km,app,此時(shí)式(3)中v0-1～[S]0,app-1雙倒數(shù)圖為一系列有著相同截距vmax-1,不同斜率km,app/vmax的直線.二級(jí)圖km,app～θ仍為一直線,其斜率與截距之比為P-1,據(jù)此可以求出分配系數(shù)P.

圖6表示在幾個(gè)固定的θ下,反應(yīng)初速度ν0對(duì)不同濃度的 VA的雙倒數(shù)曲線.由圖 6可知ν0-1～[VA]0-1雙倒數(shù)曲線皆可擬合成較好的直線,且在不同θ下,直線相交于y軸上同一點(diǎn).圖6中斜率km,app/vmax與截距vmax-1之比km,app對(duì)θ二次作圖,得一直線(圖7).直線斜率為539,截距為7.77,則有斜率/截距=69.4,即P-1=69.4,據(jù)此可算出P=70.4.

圖7 km,app對(duì)θ二次作圖Fig.7 Replot of the values of km,app versus θ

3 結(jié)論

3.1 在RL構(gòu)建的反膠束體系中 Lip催化氧化VA受反膠束納米水核pH值、含水率w0和鼠李糖脂濃度等主要因素的影響,最佳催化活力出現(xiàn)在:pH=3.8,w0=15.0,[RL]=10mmol/L處,處于最適條件下,Lip的半衰期長(zhǎng)達(dá)40h,對(duì)比Lip在反膠束介質(zhì)和膠束介質(zhì)中的催化活性可知,Lip在RL反膠束體系中表現(xiàn)出了超活性.

3.2 反膠束的納米水核高度濃縮了反應(yīng)過程中H2O2的濃度,從而使 H2O2在較低的濃度(99μmol/L)時(shí)即表現(xiàn)出對(duì)酶活的強(qiáng)烈抑制作用,因此在后續(xù)研究RL反膠束體系中Lip催化氧化VA的動(dòng)力學(xué)機(jī)制時(shí)應(yīng)該選取 H2O2的濃度范圍為 34～74μmol/L 之間.

3.3 在鼠李糖脂構(gòu)建的反膠束體系中,疏水性底物 VA主要增溶于反膠束擬相中,根據(jù)兩相模型可計(jì)算其在反膠束擬相和有機(jī)溶劑相間的分區(qū)系數(shù)為 70.4.分區(qū)系數(shù)的確定對(duì)于進(jìn)一步討論RL反膠束體系中Lip催化氧化VA的動(dòng)力學(xué)機(jī)制而言具有重要意義.

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