畢方杰，張虎，胡健

（1.山東省淄博市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 淄博 255000；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154000；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110001）

近年來，心血管疾病的發(fā)病率和致殘致死率在全世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢，雖然藥物治療與介入治療是目前主要治療手段，但均存在一定不足。因此篩選新的抗心肌缺血藥物和探索抗心肌缺血機制仍是一項重要的研究課題。梓醇作為地黃中的主要有效成份，屬于環(huán)烯醚萜單糖類。研究表明梓醇具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)。目前研究主要集中在梓醇抗腦細(xì)胞凋亡，改善氧化應(yīng)激對神經(jīng)系統(tǒng)損傷。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，梓醇在細(xì)胞水平對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞也有保護作用［1］，另有研究表明梓醇可明顯改善心功能不全。因此我們有理由進一步研究梓醇的心肌保護作用，從而為進一步研發(fā)新的有效治療心血管疾病的天然藥物提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型：

健康SPF級雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻提供方法制作心肌損傷模型［1］，采用異丙腎上腺素（每次85 mg/kg）連續(xù)皮下注射2次（間隔24 h）的方法成功建立心肌損傷模型。

1.2 材料及試劑

梓醇及丹參酮ⅡA均購自中國藥品生物制品檢定所，異丙腎上腺素購于Sigma公司，CK-MB及LDH試劑盒購于南京建成生物制品公司，所有一抗及二抗均購于Santa Cruz公司。

1.3 實驗分組

將48只Wistar大鼠分為6組，每組8只，分別是：（1）正常對照組（Control組）；（2）模型組（Model組）；（3）陽性對照組（TanshinoneⅡA 組）；（4）低劑量梓醇組（Catalpol-L 組 2.5 mg/kg）；（5）中劑量梓醇組（Catalpol-M 組 5 mg/kg）；（6） 高 劑 量 梓 醇 組（Catalpol-H 組 10mg/kg），梓醇劑量參照相關(guān)文獻［2］。所有治療組均用藥10 d，第9 d，10 d連續(xù)在用藥0.5 h后皮下給予異丙腎上腺素（每次85 mg/kg）。

1.4 心肌組織標(biāo)本的留取及檢測

最后1次用藥結(jié)束24 h后，麻醉后頸動脈取血，分離血清后，保存于冰箱內(nèi)，24 h內(nèi)用自動生化分析儀檢測CK-MB及LDH的含量。取血后立即處死大鼠取出心臟，沿冠狀溝走行分離左心室心肌，每組取4個標(biāo)本置于10%中性甲醛中固定24 h，石蠟包埋行HE染色，損傷分級及免疫組化檢測。

1.5 HE染色

將固定好的心肌組織常規(guī)石蠟包埋，Leica石蠟切片機連續(xù)切片，厚度約5 μm，HE程序染色，Olympus顯微鏡觀察病理改變。

1.6 免疫組化

按博士德公司SABC免疫組化染色試劑盒使用說明書進行操作，用0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進行熱抗原修復(fù)，DAB顯色液顯色，陰性對照以PBS代替一抗。TNF-α和IL-1β陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)有黃色或棕黃顆粒沉積，陰性對照沒有黃色顆粒沉積。在400倍高倍視野下，每張切片隨機選取5個無重疊圖像，應(yīng)用NIS Elements F2.30圖像采集軟件進行圖像采集，Image pro-plus圖像分析軟件計算平均光密度（mean optical density，MOD）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，各組實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.01為有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梓醇對各組大鼠生化指標(biāo)的影響

我們首先檢測反映心肌損傷的血清CK-MB及LDH變化，結(jié)果顯示：Model組明顯高于Control組（P<0.01）。不同劑量梓醇［（2.5～10）mg/kg］預(yù)處理后，血清LDH及CK-MB的活性下降（P<0.01），提示catalpol對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷有保護作用。見表1。

表1 各組大鼠血清CK-MB和LDH的表達（±s）Tab.1 ExpressionsofserumCK-MBandLDHinallgroups（±s）

表1 各組大鼠血清CK-MB和LDH的表達（±s）Tab.1 ExpressionsofserumCK-MBandLDHinallgroups（±s）

1）P<0.01 vs control group；2）P<0.01 vs model group.

Group CK-MB（U/L） LDH（U/L）Control group 55.23±6.28 260.41±20.01 Model group 156.74±13.901） 669.77±28.941）TanshinoneⅡA group 78.50±4.811），2） 449.85±25.381），2）Catalpol（L）group160.65±10.451）623.45±33.101），2）Catalpol（M）group130.79±12.301），2）456.40±32.041），2）Catalpol（H）group81.13±9.211），2）403.00±29.191），2）

2.2 梓醇對各組大鼠心肌病理改變的影響

結(jié)果顯示：Control組：心肌細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤。心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，居細(xì)胞中央，心肌間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，無壞死灶。Model組：有明顯的心肌缺血壞死變化，心肌細(xì)胞出現(xiàn)片狀、局灶性壞死，部分心肌保持正常。心肌細(xì)胞核變形、聚集、排列紊亂，心肌間質(zhì)增寬并部分出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維多處腫脹斷裂，肌橫紋消失，局部可見空泡樣變性。TanshinoneⅡA組及3種劑量Catalpol組：部分心肌缺血壞死變化，壞死灶呈點狀，小片狀分布，心肌間質(zhì)部分仍有炎性細(xì)胞浸潤，心肌病理改變程度和面積較模型組要小，炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕，見圖1。

2.3 各組大鼠心肌損傷分級

根據(jù)Rona提供的心肌損傷分級標(biāo)準(zhǔn)將各組大鼠心肌分為Grade 0-GradeⅣ5個級別。結(jié)果顯示：Catalpol（L）組及Catalpol（M）組心肌損傷程度均較Model組減輕，但是Catalpol（H）組心肌損傷程度減輕最為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組心肌病理損傷分級Tab.2 The pathological grades of myocardium

2.4 免疫組化檢測各組大鼠心肌TNF-α蛋白的表達

免疫組化結(jié)果顯示TNF-α蛋白陽性染色信號呈黃色，主要位于心肌細(xì)胞胞漿，Control組有少量表達，Model組較Control組明顯增多（P<0.01）。與Model組比較，TanshinoneⅡA 組、Catalpol（L） 組、Catalpol（M）組和Catalpol（H）組TNF-α蛋白表達減少（P<0.01）。見圖 2。

2.5 免疫組化檢測各組大鼠心肌IL-1β蛋白的表達

免疫組化結(jié)果顯示IL-1β蛋白陽性染色信號呈棕黃色，主要位于心肌細(xì)胞胞漿，與Control組比較，Model組表達明顯增多（P<0.01），見圖 3。經(jīng)catalpol預(yù)干預(yù)后，IL-1β蛋白表達減少（P<0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以Catalpol（H）組最顯著。

3 討論

梓醇屬于環(huán)烯醚萜單糖類，是地黃中起主要藥理作用的單體。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)梓醇具有抗凋亡［3，4］、降糖［5］、抗炎［6，7］、抗氧化應(yīng)激［8，9］等多種生物學(xué)活性，其中梓醇對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用研究最為廣泛。目前梓醇對于心血管系統(tǒng)的保護作用的研究處于起步階段，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)：梓醇通過抗氧化對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損害有明顯的保護作用［1］。在本實驗中我們進一步研究梓醇的心肌保護作用，并探討相關(guān)作用機制。

異丙腎上腺素是一種β受體激動劑，大劑量皮下注射可引起明顯的心肌損傷［1，2］，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心肌損傷的藥物試驗中。雖然其致心肌損傷的作用機制尚未完全明了，但是相關(guān)研究提示：氧化應(yīng)激［10］、炎癥反應(yīng)［11］及細(xì)胞凋亡［12］可能是主要原因。LDH是一種糖酵解酶，在全身各器官均有分布，LDH質(zhì)與量的改變，直接影響機體的能量代謝，在心肌細(xì)胞中分布尤其豐富，正常情況下，此酶不會從細(xì)胞中釋放，但是當(dāng)心肌細(xì)胞受損時，LDH大量釋放入血，因此血液中LDH的變化是反應(yīng)心肌受損的一項重要指標(biāo)。CK-MB是CK的一種同工酶，主要存在于心肌細(xì)胞的胞漿和線粒體中，它能催化肌酸和ATP之間高能磷酸鍵轉(zhuǎn)換生成磷酸肌酸和ADP的可逆反應(yīng)，為肌肉收縮提供能量。由于CK-MB特異性較高，故其活性增加被認(rèn)為是心肌細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)之一，與心肌壞死程度呈正相關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用異丙腎上腺素作用于大鼠機體后，血清CK-MB和LDH都明顯升高，表明皮下注射異丙腎上腺素可成功誘導(dǎo)心肌損傷動物模型。不同劑量梓醇預(yù)干預(yù)可明顯降低血清CK-MB和LDH的活性（P<0.01），提示梓醇對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷有明顯的保護作用。

各組大鼠心肌HE染色結(jié)果顯示：在異丙腎上腺素作用下的大鼠中，心肌損傷明顯，心肌細(xì)胞核變形、聚集、排列紊亂，心肌間質(zhì)增寬并部分出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維多處腫脹斷裂，肌橫紋消失，進一步證明異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷模型是成功的。應(yīng)用梓醇后，尤其是中劑量和大劑量梓醇可以使壞死面積明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，這一變化趨勢也在各組大鼠損傷分級比較中得到體現(xiàn)，上述結(jié)果均提示：梓醇對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷有保護作用。

炎性細(xì)胞因子是機體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的標(biāo)志，可進一步引起中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移以及最終在心肌組織的積聚，釋放溶酶體酶，損傷心肌細(xì)胞。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素作用于大鼠后，大鼠心肌有明顯的炎性細(xì)胞的滲出和間質(zhì)水腫，提示我們炎癥在異丙腎上腺素的心肌損傷中發(fā)揮重要作用TNF-α和IL-1β是誘導(dǎo)炎性細(xì)胞滲出的重要因子，他們可以在多種細(xì)胞因子的刺激下由多種細(xì)胞分泌［13］，有相關(guān)研究表明，在人體心臟損傷時，上述兩種炎癥因子明顯升高［14］。另有實驗發(fā)現(xiàn)［15，16］阻止 TNF-α 和 IL-1β 的表達可以明顯改善梗死心肌的心功能，因此抑制炎癥反應(yīng)是保護心肌損傷的一種有效方法。以往的研究發(fā)現(xiàn)，梓醇可以抑制脂多糖（LPS）引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，限制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)性氧自由基（ROS）和一氧化氮（NO），降低誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）的表達［17］，表明梓醇在LPS介導(dǎo)的炎癥損傷中起到抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥因子產(chǎn)生的作用。在Aβ1-42損傷的小鼠大腦皮層神經(jīng)-膠質(zhì)混合細(xì)胞培養(yǎng)體系中，梓醇一方面直接保護神經(jīng)元免受神經(jīng)毒性損傷，另一方面通過抑制小膠質(zhì)和星型膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子TNF-α的過量表達，間接保護神經(jīng)元，通過抗炎發(fā)揮神經(jīng)保護作用［18］。因此為了進一步探討梓醇對心肌損傷的保護機制，我們從炎癥角度檢測了心肌組織TNF-α和IL-1β蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在異丙腎上腺素處理組的大鼠心肌上述兩種因子表達明顯升高，而梓醇預(yù)處理后，尤其在中劑量和高劑量梓醇組，上述兩種因子的表達明顯減少，提示梓醇通過抑制炎癥因子的表達實現(xiàn)保護心肌的作用。

總之，本實驗表明梓醇可以阻止異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷，這種保護作用可能是通過抑制炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)的，此結(jié)果將為篩選具有心肌保護作用的中藥單體提供更多實驗依據(jù)及理論依據(jù)。

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