王呈仲，樊偉，包曉麗，袁慧慧，藍閩波

（華東理工大學上海市功能性材料化學重點實驗室/分析測試中心，上海 200237）

益智果實乙酸乙酯部位抗氧化活性研究

王呈仲，樊偉，包曉麗，袁慧慧，藍閩波*

（華東理工大學上海市功能性材料化學重點實驗室/分析測試中心，上海 200237）

摘 要：研究益智果實乙酸乙酯部位的抗氧化能力。采用液液分配法從益智果實乙醇提取物中萃取得到乙酸乙酯部位，用硅膠柱色譜對其進一步分離純化，得到4個洗脫部分。分別采用DPPH·清除法、ABTS·+清除法、總還原能力以及福林酚方法測定5個提取物的抗氧化能力和總多酚含量。實驗結果表明，益智果實乙酸乙酯部位及其各部分均具有較強的抗氧化能力，其中石油醚∶乙酸乙酯（4∶1，體積比）洗脫部分的抗氧化能力最強。各提取物總多酚含量測定結果與其抗氧化能力呈正相關，表明提取物中起抗氧化作用的物質主要為多酚類化合物。

關鍵詞：益智；乙酸乙酯部位；抗氧化活性；總多酚含量

益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）是姜科山姜屬多年生草本植物，主產于我國華南地區(qū)如海南、廣東和廣西等地。益智是我國四大南藥之一，中國藥典收錄中藥材益智仁為益智干燥成熟果實，其性辛、溫，歸脾腎經，具有溫脾止瀉、攝唾涎、暖腎、固精縮尿之功效，臨床上主要用于治療脾寒泄瀉，腹中冷痛，口多唾涎，腎虛遺尿，小便頻數(shù)，遺精白濁等癥[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)益智化學成分以揮發(fā)油、萜類、庚烷類、黃酮類以及微量元素為主[2-4]，具有神經保護、抗癌、強心、抗氧化以及抗過敏等多種作用[5-9]。同時益智也是衛(wèi)生部公布的藥食同源植物之一，其性溫和、味辛辣且香濃，風味獨特，營養(yǎng)豐富，富含多種氨基酸、礦物質和維生素，在民間則一直被視為食藥兼用佳品，海南一些地區(qū)居民即有飲用益智茶的習俗。目前，益智已被制作成果脯、益智酒等食品[10-11]，是一種難得的開發(fā)新型保健食品的良好資源。

鑒于益智的醫(yī)藥功能和營養(yǎng)價值，我們前期對益智營養(yǎng)及保健作用進行了初步評價，發(fā)現(xiàn)益智乙醇提取物的乙酸乙酯部位具有較強的抗氧化作用，值得進一步深入探討。因此采用多種方法對益智乙酸乙酯部位的抗氧化能力進行了研究，并對該部位進行初步分離純化，對得到的4個分離部分的抗氧化作用也進行了評價與比較。本文結論旨在揭示益智營養(yǎng)保健作用，為進一步開發(fā)和利用益智以及開發(fā)新型食品天然抗氧化劑、藥物等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1材料

益智：產于廣西，購于上海雷允上藥業(yè)連鎖藥店，粉碎后過40目篩備用。

1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH·）、ABTS和Folin-Ciocalteu reagent購自于Sigma-Aldrich試劑公司；其他試劑均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司。

1.1.2 儀器

R206 SENCOR旋轉蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；SH-III型循環(huán)水式真空泵：上海羌強儀器設備有限公司；L-906483電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備廠；FA2004電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；FE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-100DA數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Evolution 220 UV-Visible Spectrometer：ThermoFisher Scientific-Shanghai。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備

稱取一定量益智粉末，用95%乙醇浸泡24 h后回流提取，重復進行3次，合并濾液后減壓回收溶劑得到益智乙醇粗提物。將乙醇粗提物用水溶解，先用石油醚除脂后，再用乙酸乙酯進行萃取，得到乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物進一步硅膠柱色譜分離，以不同比例的石油醚∶乙酸乙酯（4∶1、1∶1、1∶3、0∶1，體積比），進行梯度洗脫，得到4個洗脫部分。將益智乙酸乙酯萃取物和4個洗脫部分干燥后備用。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定

用無水乙醇配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH·溶液，避光保存?zhèn)溆谩７謩e取不同濃度的樣品乙醇溶液2.0 mL，DPPH·溶液2.0 mL于試管中，充分混合。空白對照為2.0 mL無水乙醇和2.0 mL的DPPH·溶液混合均勻。常溫避光反應60 min后于517 nm處測定吸光度。每個濃度平行測定3次，取其平均值。以無水乙醇做參比液，VC做陽性對照。DPPH自由基清除率采用下面公式計算：

其中：Asample為樣品溶液的吸光度；Acontrol為空白對照溶液的吸光度；結果以樣品溶液清除DPPH自由基50%時的濃度，即IC50表示。IC50值越小，表明樣品清除自由基的能力越強。

1.2.3 ABTS·+自由基清除能力測定

7 mmoL/L的ABTS水溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液在暗處反應12 h～16 h。反應結束后用無水乙醇稀釋至反應液在波長734 nm處的吸光度在0.700±0.05范圍內。100 μL不同濃度的樣品乙醇溶液與900 μL的ABTS·+溶液在室溫下暗處混合反應，10 min后在波長734 nm處測定吸光度，以樣品溶劑無水乙醇做空白對照，無水乙醇做參比液。VC為陽性對照。清除率以下面公式計算：

其中：Asample為樣品溶液的吸光度；Acontrol為空白對照溶液的吸光度；結果以樣品溶液清除ABTS·+自由基50%時的濃度，即IC50表示。每個濃度平行測定3次，結果取其平均值。

1.2.4 總還原力的測定

取不同濃度的樣品乙醇溶液2.5 mL，分別加入2.5 mL 的 PBS（0.2 moL/L，pH6.6）和 2.5 mL 的鐵氰化鉀溶液（1 g/100 mL），混勻，在50℃水浴保溫20 min后，快速冷卻；再加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10 g/100 mL），混合后以3000r/min轉速離心10min。取上清液2.5mL，依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL的三氯化鐵溶液（0.1 g/100 mL）。振蕩混勻后靜置10 min，在波長700 nm下測定吸光度值。每個濃度平行測定3次，取其平均值。吸光度越大表示還原力越強。以樣品溶劑乙醇做空白對照，VC做陽性對照。

1.2.5 總多酚含量測定

0.5 mL樣品乙醇溶液（10 mg/mL）與7 mL蒸餾水以及0.5 mL福林試劑混合均勻，室溫下靜置3 min，隨后加入2 mL碳酸鈉水溶液（20 g/100 mL），充分搖勻后在暗處保持1 h，然后在波長738 nm處測定吸光度。標準曲線用沒食子酸來測定，分別取0～100 μg/mL的沒食子酸溶液在同樣條件下測定。結果以1 g提取物中所含的沒食子酸當量來表示。

2 結果與討論

2.1 益智提取物對DPPH·的清除能力

DPPH自由基清除能力測定是一種常用的測定抗氧化物質活性的方法。DPPH自由基有一個單電子，其乙醇溶液呈深紫色。當有抗氧化物質存在時，DPPH·的單電子被配對轉變?yōu)榉€(wěn)定的抗磁性分子而使其乙醇溶液顏色變淺，溶液褪色的程度代表著抗氧化物質清除自由基的能力的高低。

益智乙酸乙酯部位及其4個洗脫部分對DPPH·的清除能力結果如圖1所示。

圖1 益智乙酸乙酯部位及其各洗脫部分的DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging activity of the ethyl acetate extract and its subfractions from Alpinia oxyphylla fruits

實驗結果表明，各提取物在測試濃度范圍內（12.5 μg/mL～200 μg/mL）均具有較強清除 DPPH 自由基的能力，并且清除能力隨著濃度的增加而增強，呈現(xiàn)出明顯的濃度－清除率效應。其清除能力順序為石油醚∶乙酸乙酯（4∶1，體積比）＞乙酸乙酯部位＞石油醚∶乙酸乙酯（1∶1，體積比）＞石油醚∶乙酸乙酯（1∶3，體積比）＞石油醚∶乙酸乙酯（0∶1，體積比）。石油醚∶乙酸乙酯（4∶1，體積比）表現(xiàn)出最強的清除 DPPH·能力，其IC50值為 21.1 μg/mL（見表1），明顯低于其他提取物的IC50值，且與陽性對照VC的清除能力相當（IC50值為19.8 μg/mL）。此外，其他3個洗脫部分的DPPH·清除能力要弱于乙酸乙酯部位，提示乙酸乙酯部位的抗氧化活性成分主要集中在了石油醚∶乙酸乙酯 （4∶1，體積比）部分。

表1 益智乙酸乙酯部位及其各洗脫部分總多酚含量以及清除DPPH·和 ABTS·+自由基能力Table 1 The total phenolic content and radical scavenging activities of the ethyl acetate extract and its subfractions from Alpinia oxyphylla fruits

2.2 益智提取物對ABTS·+的清除能力

益智乙酸乙酯部位及其4個洗脫部分在測試濃度范圍內（12.5 μg/mL～200 μg/mL）顯示出很強的清除ABTS·+的能力，結果如圖 2 所示。

圖2 益智乙酸乙酯部位及其各洗脫部分的ABTS·+自由基清除能力.Fig.2 ABTS·+radical scavenging activity of the ethyl acetate extract and its subfractions from Alpinia oxyphylla fruits

各提取物的清除ABTS·+自由基能力依次為石油醚：乙酸乙酯（體積比，4∶1）＞乙酸乙酯部位＞石油醚∶乙酸乙酯（體積比，1∶1）＞石油醚：乙酸乙酯（體積比，1∶3）＞石油醚∶乙酸乙酯 （體積比，0∶1），該順序與DPPH·清除順序相同。石油醚∶乙酸乙酯（體積比，4∶1）清除 ABTS·+能力最強（IC50：33.4 μg/mL），而其他 3個洗脫部分的ABTS·+清除能力小于乙酸乙酯部位，表明石油醚∶乙酸乙酯（體積比，4∶1）部分包含了乙酸乙酯部位的主要抗氧化成分。與陽性對照VC相比較，石油醚∶乙酸乙酯（體積比，4∶1）部分清除 ABTS·+自由基的能力與VC相當，但其他提取物的清除能力要弱于 VC（見表 1）。

2.3 益智提取物總還原能力測定

在總還原能力測定中，抗氧化物質將Fe3+－鐵氰化物復合物還原為二價鐵離子形式。測定該反應在700 nm處的吸光度來評價其還原能力的高低，吸光度越高表明抗氧化物質的還原能力越強。

益智各提取物的總還原能力測定結果如圖3所示。

圖3 益智乙酸乙酯部位及其各洗脫部分的總還原能力.Fig.3 Total antioxidant capacity of the ethyl acetate extract and its subfractions from Alpinia oxyphylla fruits

各提取物的還原能力隨著濃度的增加而增加，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。5種提取物的總還原能力強弱順序與其清除DPPH·和ABTS·+的能力一致，即為石油醚∶乙酸乙酯（體積比，4∶1）＞乙酸乙酯部位＞石油醚∶乙酸乙酯（體積比，1∶1）＞石油醚∶乙酸乙酯（體積比，1∶3）＞石油醚∶乙酸乙酯（體積比，0∶1）。在各提取物中，石油醚∶乙酸乙酯（體積比，4∶1）部分的還原能力最強，但要弱于陽性對照VC。

2.4 益智提取物總多酚含量測定結果

益智各提取物的總多酚含量如表1所示，其含量順序為石油醚∶乙酸乙酯 （體積比，4∶1）＞乙酸乙酯部位＞石油醚∶乙酸乙酯 （體積比，1∶1）＞石油醚∶乙酸乙酯（體積比，1∶3）＞石油醚∶乙酸乙酯（體積比，0∶1）。該順序與其清除自由基（DPPH·和 ABTS·+）和總還原能力的順序一致。石油醚：乙酸乙酯（體積比，4∶1）部分所含的多酚類化合物當量最高，為36.6 mg沒食子酸當量/g提取物。

2.5 益智提取物抗氧化能力與總多酚含量的關系

多酚類化合物是植物提取物發(fā)揮抗氧化作用的主要物質之一。為研究益智各提取物的抗氧化能力與其所含多酚類物質的關系，本文對益智乙酸乙酯部位及其4個洗脫部分清除DPPH·和ABTS·+能力與總多酚含量的關系進行了分析，結果如圖4和圖5所示。兩種自由基清除能力與總多酚含量之間表現(xiàn)出較強的相關性，其相關系數(shù)（R2）分別為0.906 1和0.842 7，表明益智各提取物的抗氧化能力與其所含的多酚類化合物密切相關，這與其它植物提取物的抗氧化能力和總多酚含量的相關性研究結果相類似 ，由此證實益智乙酸乙酯部位所含的多酚類物質是其抗氧化活性成分。

圖4 益智乙酸乙酯部位及其各洗脫部分清除DPPH·自由基能力與總多酚含量的關系Fig.4 Correlation between the DPPH·radical scavenging activity and total phenolic content of the ethyl acetate extract and its subfractions of Alpinia oxyphylla fruits

圖5 益智乙酸乙酯部位及其各洗脫部分清除ABTS·+自由基能力與總多酚含量的關系Fig.5 Correlation between the ABTS·+radical scavenging activity and total phenolic content of the ethyl acetate extract and its subfractions of Alpinia oxyphylla fruits

3 結論

研究結果表明，益智乙酸乙酯部位及其4個洗脫部分均具有很強的抗氧化能力，依次為石油醚∶乙酸乙酯 （體積比，4∶1）＞乙酸乙酯部位＞石油醚∶乙酸乙酯（體積比，1∶1）＞石油醚∶乙酸乙酯 （體積比，1∶3）＞石油醚∶乙酸乙酯（體積比，0∶1）。值得注意的是各提取物的多酚類化合物含量的順序與其抗氧化能力相同，而且兩者之間存在著很好的相關性，表明多酚類化合物對益智乙酸乙酯部位的抗氧化能力起著主要作用。石油醚∶乙酸乙酯（體積比，4∶1）洗脫部分具有最強的抗氧化活性，其抗氧化能力與VC相當；同時該部分的總多酚含量也為最高，提示乙酸乙酯部位起抗氧化作用的酚類化合物集中在該部分。目前從益智乙酸乙酯部位分離出了一些酚類物質如益智酮甲、益智酮乙、楊芽黃素和原兒茶酸等化合物[14]，這些化合物有可能是該部位抗氧化作用的物質基礎。益智乙酸乙酯部位，特別是其石油醚∶乙酸乙酯（體積比，4∶1）洗脫部分的很強的抗氧化作用佐證了益智果實對人體的抗衰老等營養(yǎng)保健作用，同時其中所含的酚類化合物具有開發(fā)成食品天然抗氧化劑、藥物以及化妝品添加劑的潛力。

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Study on Antioxidant Activity of the Ethyl Acetate Fraction of the Fruit of Alpinia Oxyphylla

WANG Cheng-zhong，F(xiàn)AN Wei，BAO Xiao-li，YUAN Hui-hui，LAN Min-bo*
（Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry，and Research Center of Analysis and Test，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Abstract：Antioxidant activities of the ethyl acetate fraction of the fruit ofAlpinia oxyphyllawere investigated in this work.Ethyl acetate fraction was obtained from the ethanol extract of the fruit ofAlpinia oxyphyllaby using liquid-liquid partition，and then was further separated by silica gel column chromatography to acquire four subfractions.The total phenolic content and antioxidant activity of the ethyl acetate fraction and its four subfractions were determined by Folin-Ciocalteu method and DPPH·， ABTS·+， and reducing power assay.The results showed that the ethyl acetate fraction and its subfractions possessed significant antioxidant effect against free radicals and reducing power， of which the subfraction eluted by petroleum ether：ethyl acetate （4∶1，volume ratio）exhibited the most potent antioxidant activity.Meanwhile the total phenolic content of the fractions was found to be positive correlation to their antioxidant activity，suggesting that the phenolic compounds may be responsible for the antioxidant effect of these fractions.

Key words：Alpinia oxyphylla；ethyl acetate fraction；antioxidant activity；total phenolic content

上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字2010第2-1號）

王呈仲（1983—），男（漢），在讀博士，研究方向：天然產物活性成分研究。

2013-03-25