陳 騁，張 麗，韓 玲，*，余群力，張文華

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州 730070；2.寧夏廈華肉食品有限公司，寧夏中衛(wèi)755000）

?；撬幔═aurine），化學名稱為β-氨基乙磺酸（NH2-CH2-CH2-SO3H），1827年首次從牛膽汁中分離出來，又稱牛膽素、牛膽酸[1]。牛磺酸是人重要的營養(yǎng)素，對調(diào)節(jié)機體中樞、消化、生殖、免疫和內(nèi)分泌等系統(tǒng)生理功能有重要的作用[2-3]。隨著我國西部藏區(qū)畜牧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，臟器等牛副產(chǎn)物的產(chǎn)量日趨增加。根據(jù)國家統(tǒng)計局及農(nóng)業(yè)部的資料，2010年屠宰牦牛約為189.7萬頭，體重350kg左右，其臟器總產(chǎn)量約為6萬t[4-5]。然而，牦牛肝臟很可能富含?；撬?，如果能夠從牦牛臟器中提取天然?；撬幔_定最佳的提取工藝，對于提高牦牛臟器綜合利用效率具有極其重要的意義，同時還可以緩解人工合成?；撬崴鶐淼陌踩碍h(huán)境問題[6]。此外，目前尚無針對牦牛臟器中牛磺酸提取及含量分析的權(quán)威方法，相關(guān)的國家標準及行業(yè)標準均屬空白，無法準確分析牦牛臟器中?；撬岬暮浚y以評估其市場前景。因此，優(yōu)化牦牛臟器中牛磺酸的提取方法，可以為建立牦牛臟器中?；撬岬臋z測標準提供理論基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于動物機體中提取天然?；撬岬难芯繄蟮?，其主要研究對象為海產(chǎn)貝類或其他水產(chǎn)品[7]。2000年，錢俊青等[8]研究了珍珠貝母體中提取?；撬岬墓に嚒?005年，李和生等[9]研究了從蛤蜊中提取?；撬岬墓に?。2010年，楊廣會等[3]研究了從魷魚肝臟中提取?；撬岬墓に嚒Ｈ欢?，目前尚未見針對牦牛臟器中?；撬崽崛」に囇芯康膱蟮?。本研究采用均勻?qū)嶒炘O(shè)計法，針對青海海北地區(qū)牦牛內(nèi)臟（心臟、肝臟、肺臟、腎臟）中?；撬岬奶崛」に噮?shù)進行優(yōu)化，并以最佳工藝進行心臟、肝臟、肺臟和腎臟四種臟器中?；撬崽崛。捎米贤饪梢姺止夤舛确y定其含量，分析海北牦牛4種臟器中牛磺酸含量，以期為今后進一步利用牦牛臟器中?；撬豳Y源，開發(fā)高附加值產(chǎn)品提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青海海北藏族自治州成年牦牛臟器（心臟、肝臟、肺臟、腎臟）樣品采后在-20℃條件下冷凍保存，一周內(nèi)進行實驗；?；撬針藴势?上海國藥集團化學試劑有限公司；732型強酸性陽離子交換樹脂 河北華眾化工有限公司；乙酰丙酮 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；甲醛 天津市化學試劑六廠；氫氧化鈉、濃鹽酸、醋酸鈉 天津市化學試劑三廠；以上試劑均為分析純。

756P型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；JJ-2B型組織搗碎機 金壇市醫(yī)療儀器有限公司；L5000型高速臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；PHS-3C型酸度計 上海佑科儀器儀表有限公司；LE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；離子交換柱（25mm×30cm）深圳市深泉科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛臟器中?；撬岷繙y定

1.2.1.1 標準曲線的繪制 使用?；撬針藴势贩謩e配制0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45mg/mL的牛磺酸標準溶液，在最大吸收波長400nm[7]處依次測定吸光值，以吸光值（Y）對?；撬針藴嗜芤簼舛龋╔）繪制標準曲線并求得回歸方程。

1.2.1.2 顯色劑的配制 吸取1.0mol·L-1的醋酸鈉溶液10.0mL，依次加入0.4mL乙酰丙酮、1.0mL甲醛，并加蒸餾水稀釋至25.0mL，實驗當天配制[9]。

1.2.1.3 樣品測定 ?；撬崤c乙酰丙酮和甲醛經(jīng)加熱反應(yīng)生成N-取代基2，6-二甲基-3，5-二乙?；?1，4-二氫吡啶，該配合物顯黃色。從待測樣品中吸取1mL（1.2.2.2）收集的溶液，10倍稀釋。吸取2mL稀釋液，加入1mL顯色劑，100℃下水浴15min，隨后冷卻至室溫，于400nm波長下測定其吸光值[10]。

1.2.1.4 牛磺酸含量計算公式

式中：X—吸光值；0.0026—?；撬針藴是€回歸方程的截距；1.9929—?；撬針藴是€回歸方程的斜率；10—稀釋倍數(shù)，用于吸光值測定時溶液（1mL）中牛磺酸濃度（mg/mL）換算為?；撬豳|(zhì)量（mg）；25—體積比，用于吸光值測定時溶液（1mL）中牛磺酸質(zhì)量（mg）換算為過柱時溶液中?；撬岬馁|(zhì)量（mg）；5—體積比，用于過柱后溶液中牛磺酸質(zhì)量（mg）換算為濃縮液中?；撬岬馁|(zhì)量（mg）。

1.2.2 牦牛臟器?；撬崽崛」に噧?yōu)化

1.2.2.1 ?；撬崽崛」に嚵鞒?牦牛臟器→勻漿→自溶→提取→除蛋白→脫色濃縮→過柱除雜→待測。

1.2.2.2 操作要點 a.前處理：稱取原料25.0g，按1∶4（m∶v）加入蒸餾水，置于組織搗碎機中勻漿，至糜狀[3]。

b.自溶：采用2mol/L的鹽酸溶液調(diào)勻漿后組織液pH至5.5，組織液隨后置于50℃水浴鍋內(nèi)，恒溫水浴20h[3]。

c.提取：自溶結(jié)束后，調(diào)水浴鍋溫度至80℃，繼續(xù)恒溫提取50min，隨后采用四層細紗布過濾，收集濾液[3]。

d.除蛋白：除酸性蛋白：采用1∶1（v∶v）的鹽酸調(diào)濾液pH至3.5，4500r/min下離心20min，收集上清液；

除堿性蛋白：采用5mol/L的氫氧化鈉調(diào)除去酸性蛋白后上清液pH至8.5，4500r/min下離心20min，收集上清液[9-10]。

e.脫色濃縮：上清液中加入適量活性炭（每100mL加入2～3g）進行脫色，過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，待上清液濃縮至50mL，采用2mol/L的鹽酸溶液調(diào)濃縮液pH至4.5[10]。

f.去除其他雜質(zhì)：離子交換柱：除去蛋白質(zhì)及色素后，提取液中仍然含有干擾?；撬釡y定的甘氨酸、賴氨酸等氨基酸，當?；撬崧倭鹘?jīng)強酸性陽離子交換樹脂時，這些氨基酸會保留到樹脂上，而?；撬岜幌疵撓聛淼玫椒蛛x[6]。本實驗采用732型強酸性陽離子樹脂進行濕法裝柱，樹脂填充高度4cm，除去管中氣泡待用[11]。

g.過柱：吸取10mL（e）中收集的濃縮液緩慢注入732型強酸性陽離子樹脂交換柱，采用蒸餾水進行洗脫，每次5mL，共3次，收集此溶液25mL，即為待測樣品[9]。

1.2.2.3 牦牛臟器中?；撬崽崛」に噧?yōu)化 采用均勻?qū)嶒炘O(shè)計方法針對料液比、自溶溫度、提取溫度、提取時間4個因素組合實驗，進行?；撬崽崛」に噧?yōu)化。

a.因素水平的確立：本實驗4因素中，料液比（m∶v）水平范圍分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6；自溶溫度水平范圍為30、35、40、45、50、55℃；提取溫度水平范圍為70、75、80、85、90、95℃；提取時間水平范圍為30、40、50、60、70、80min。

b.因素水平均勻?qū)嶒炘O(shè)計：本實驗采用4因素6水平的均勻設(shè)計U6（46），因素水平表如表1所示。

表1 均勻設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of the uniform design

c.驗證實驗：對均勻?qū)嶒炘O(shè)計獲得的理論最佳工藝參數(shù)進行驗證，參照（1.2.2.2）?；撬崽崛》椒ǎ捎弥庇^分析法從均勻?qū)嶒炘O(shè)計的實驗結(jié)果中選出理論最佳工藝參數(shù)針對青海海北牦牛肝臟進行?；撬崽崛?，測定其含量，與回歸方程計算的預(yù)測值進行比較、驗證。

1.2.3 牦牛不同臟器中牛磺酸含量分析 以（2.2，2.3）確定的牛磺酸最佳提取工藝參數(shù)，對青海海北牦牛臟器（心臟、肝臟、肺臟、腎臟）中的?；撬徇M行提取，并測定其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線回歸方程的確定

牛磺酸標準曲線如圖1所示。

圖1 牛磺酸標準溶液濃度與吸光值關(guān)系曲線Fig.1 Standard curve of taurine

回歸方程為：Y=1.9929X-0.0026，R2=0.997，說明?；撬針藴嗜芤簼舛仍?.00～0.45mg/mL的范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 ?；撬嶙罴烟崛」に?/h3>

根據(jù)表1中的均勻設(shè)計方案，對牦牛肝臟中的牛磺酸進行提取，并測定其含量，結(jié)果如表2所示。

表2 均勻設(shè)計實驗結(jié)果（n=12）Table 2Results of uniform design experiment（n=12）

根據(jù)表2結(jié)果，以牛磺酸提取量為因變量，液料比（X1）、自溶溫度（X2）、提取溫度（X3）、提取時間（X4）為自變量，采用IBM SPSS Statistics 19軟件對實驗結(jié)果進行多元線性和二次多項式逐步回歸分析，得回歸方程：

Y=-3.731+0.246X3+0.001X1X4+0.001X2X4-0.002X32

對方程進行顯著性檢驗，R2=0.998，F(xiàn)=150723.36（p＜0.01），說明該方程具有顯著意義。進一步對各項系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，方程各項系數(shù)中，提取溫度（X3），提取溫度的二次方（X32）以及自溶溫度、提取時間的交互作用（X2X4）的影響均為極顯著（p＜0.01）；料液比、提取時間的交互作用（X1X4）的影響為顯著（p＜0.05）。由于方程中各項系數(shù)單位不一致不能直接進行比較，故對回歸系數(shù)進行標準化，各項標準化系數(shù)如表4所示。

表3 回歸項系數(shù)檢驗Table 3 Regression coefficient test

表4 標準化回歸系數(shù)Table 4 The standardized regression coefficient

由表4可知，各因素對牦牛肝臟中?；撬崽崛∮绊憦娙醯捻樞驗椋禾崛囟龋╔3）＞自溶溫度、提取時間交互作用（X2X4）＞料液比、提取時間交互作用（X1X4）。其中，提取溫度為?；撬崽崛≈凶钪饕挠绊懸蛩?，自溶溫度、提取時間為次要因素，而料液比的影響最小。

提取溫度是影響牦牛臟器中?；撬崽崛〉淖钪饕蛩?，提取時間和自溶溫度為次要因素，與楊光輝等[3]的研究結(jié)果一致，其在魷魚肝臟中?；撬崽崛」に嚄l件的研究中發(fā)現(xiàn)提取溫度為影響魷魚肝臟中?；撬崽崛〉闹饕蛩?，提取時間為次要因素，且80℃下提取50min為最佳組合，與本實驗（2.2）確定的75℃下提取60min的最佳組合在同一梯度區(qū)間。陳秋虹等[5]研究發(fā)現(xiàn)?；撬崽崛囟葢?yīng)控制在70℃左右，溫度過高，可溶性蛋白質(zhì)溶出變性，溶液粘度增大，反而影響?；撬岬奶崛×俊Ｒ虼?，本實驗確定牦牛臟器中牛磺酸的最佳提取溫度為75℃，提取時間為60min。

自溶溫度為影響牛磺酸提取的另一次要因素，（2.2）中最佳自溶溫度為55℃，楊光輝等[3]在針對魷魚肝臟中牛磺酸提取的研究發(fā)現(xiàn)，55℃下自溶22h，牛磺酸的提取量最高，同時發(fā)現(xiàn)自溶時間超過20h后，牛磺酸的提取量急劇下降，與本實驗結(jié)果一致。

料液比對牦牛臟器中?；撬岬挠绊懽钚?，楊光輝等[3]、錢俊青等[8]、李和生等[9]在針對不同原料中?；撬崽崛〉难芯恐芯l(fā)現(xiàn)料液比為最小影響因素，這主要是由于?；撬峋哂辛己玫乃苄?。

因此，牦牛臟器中牛磺酸理論最佳提取工藝為：料液比為1∶3（m∶v），自溶溫度為55℃，提取溫度為75℃，提取時間60min。

2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)驗證

預(yù)測值：針對（2.2）獲得的?；撬崽崛±碚撟顑?yōu)工藝：料液比1∶3（m∶v），自溶溫度55℃，提取溫度75℃，提取時間60min代入（2.2）獲得的回歸方程，得到牛磺酸含量預(yù)測值為6.95mg/g。

驗證：采用（2.2）獲得的理論最優(yōu)提取工藝參數(shù)，對青海海北牦牛肝臟中的?；撬徇M行提取，并測定其含量，做3次平行，實際測得?；撬岷繛椋?.90±0.10）mg/g。

通過驗證實驗發(fā)現(xiàn)，青海海北牦牛肝臟中?；撬岬念A(yù)測值為6.95mg/g，實際含量為6.90mg/g，二者僅相差0.05mg/g。因此，青海海北牦牛臟器中牛磺酸最佳提取工藝參數(shù)為：料液比為1∶3（m∶v），自溶溫度為55℃，提取溫度為75℃，提取時間60min。

2.4 牦牛不同臟器中?；撬岷糠治?/h3>

采用（2.2，2.3）確定的最佳工藝參數(shù)，分別對青海海北牦牛肝、腎、心、肺四種臟器中的?；撬徇M行提取，并測定其含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同臟器?；撬岷縁ig.2 Taurine content of yak organs

對4種臟器中牛磺酸含量進行Duncan’s新復(fù)極差多重比較，發(fā)現(xiàn)青海海北牦牛4種臟器之間?；撬岷烤嬖跇O顯著的差異，肝臟含量（7.02mg/g）極顯著高于其他臟器（p＜0.01），腎臟中含?；撬?.59mg/g顯著、極顯著高于肺臟（4.46mg/g）和心臟（2.50mg/g）中?；撬岷浚╬＜0.05，p＜0.01）。

肝臟和腎臟中牛磺酸的高含量主要是由于肝臟是?；撬嶙钪饕暮铣善鞴?，腎臟是?；撬崤判沟钠鞴賉12]，實驗結(jié)果符合?；撬嵩诓溉閯游餀C體中的代謝及分布特點。盡管青海海北牦牛肝臟中?；撬岷?.02mg/g略低于魷魚肝臟（7.36mg/g）[3]，但以我國每年加工魷魚約20萬t[13]計算，魷魚肝臟約占魷魚體重的15%[3]，即每年可用來提取?；撬岬聂滛~肝臟為3萬t左右，而牦牛肝臟約占牦牛平均體重（360kg）的1.2%，以2010年全國牦牛屠宰量189.7萬頭計算，可用于?；撬崽崛〉年笈８闻K就達8萬t，遠高于魷魚肝臟原料量。因此，牦牛肝臟資源豐富，可以作為天然?；撬岬牧己脕碓?。此外，牦牛腎臟中?；撬岷浚?.59mg/g）遠低于牦牛和魷魚肝臟中含量，但高于蛤蜊中?；撬岷浚?.85mg/g）[9]，也可作為天然?；撬彷^好的來源。

3 結(jié)論

本實驗選用青海海北牦牛肝臟、心臟、肺臟和腎臟為原料，通過優(yōu)化?；撬嶙罴烟崛」に嚕Σ煌K器中?；撬岷窟M行分析，得到以下結(jié)論：

3.1 牦牛臟器中?；撬岬淖罴烟崛」に噮?shù)：料液比為1∶3（m∶v），自溶溫度為55℃，提取溫度為75℃，提取時間60min。

3.2 海北牦牛不同臟器中，肝臟含量（7.02mg/g）極顯著高于其他臟器（p＜0.01），腎臟中含牛磺酸5.59mg/g顯著、極顯著高于肺臟（4.46mg/g）和心臟（2.50mg/g）中牛磺酸含量（p＜0.05，p＜0.01）。

因此，牦牛肝臟和腎臟中蘊含著豐富的牛磺酸資源，采用科學的提取方法，在滿足對天然牛磺酸需求的同時，也實現(xiàn)了牦牛副產(chǎn)物的綜合開發(fā)利用，帶動畜牧業(yè)循環(huán)經(jīng)濟的健康發(fā)展。

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